Growth data from a field trial of Quercus suber plants regenerated from selected trees and their half-sib progenies by somatic embryogenesis

The development of reliable clonal propagation technologies is a requisite for performing Multi-Varietal Forestry (MVF). Somatic embryogenesis is considered the tissue culture based method more suitable for operational breeding of forest trees. Vegetative propagation is very difficult when tissues are taken from mature donors, making clonal propagation of selected trees almost impossible. We have been able to induce somatic embryogenesis in leaves taken from mature oak trees, including cork oak (Quercus suber). This important species of the Mediterranean ecosystem produces cork regularly, conferring to this species a significant economic value. In a previous paper we reported the establishment of a field trial to compare the growth of plants of somatic origin vs zygotic origin, and somatic plants from mature trees vs somatic plants from juvenile seedlings. For that purpose somatic seedlings were regenerated from five selected cork oak trees and from young plants of their half-sib progenies by somatic embryogenesis. They were planted in the field together with acorn-derived plants of the same families. After the first growth period, seedlings of zygotic origin doubled the height of somatic seedlings, showing somatic plants of adult and juvenile origin similar growth. Here we provide data on height and diameter increases after two additional growth periods. In the second one, growth parameters of zygotic seedlings were also significantly higher than those of somatic ones, but there were not significant differences in height increase between seedlings and somatic plants of mature origin. In the third growth period, height and diameter increases of somatic seedlings cloned from the selected trees did not differ from those of zygotic seedlings, which were still higher than data from plants obtained from somatic embryos from the sexual progeny. Therefore, somatic seedlings from mature origin seem not to be influenced by a possible ageing effect, and plants from somatic embryos tend to minimize the initial advantage of plants from acorns

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Development of somatic embryogenesis for cloning and conservation of mature holm oak trees (Quercus ilex L.)

La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

Uncertainty assessment methodologies applied to Tritium production in fusion lithium breeding blankets

- Need of Tritium production - Neutronic objectives - The Frascati experiment - Measurements of Tritium activity

Future trends in Animal Breeding due to new genetic tecnologies

The Darwin theory of evolution by natural selection is based on three principles: (a) variation; (b) inheritance; and (c) natural selection. Here, I take these principles as an excuse to review some topics related to the future research prospects in Animal Breeding. With respect to the first principle I describe two forms of variation different from mutation that are becoming increasingly important: variation in copy number and microRNAs. With respect to the second principle I comment on the possible relevance of non-mendelian inheritance, the so-called epigenetic effects, of which the genomic imprinting is the best characterized in domestic species. Regarding selection principle I emphasize the importance of selection for social traits and how this could contribute to both productivity and animal welfare. Finally, I analyse the impact of molecular biology in Animal Breeding, the achievements and limitations of quantitative trait locus and classical marker-assisted selection and the future of genomic selection

Water harvesting for young trees using Peltier plates powered by photovoltaic solar energy

Young trees transplanted from nursery into open field require a minimum amount of soil moisture to successfully root in their new location, especially in dry-climate areas. One possibility is to obtain the required water from air moisture. This can be achieved by reducing the temperature of a surface below the air dew point temperature, inducing water vapor condensation on the surface. The temperature of a surface can be reduced by applying the thermoelectric effect, with Peltier modules powered by electricity. Here, we present a system that generates electricity with a solar photovoltaic module, stores it in a battery, and finally, it uses the electricity at the moment in which air humidity and temperature are optima to maximize water condensation while minimizing energy consumption. Also, a method to reduce the evaporation of the condensed water is proposed. The objective of the system, rather than irrigating young plants in such a degree as to boost their growth, is to maintain them alive in the dryer periods.

Optimizing rabbit production under heat stress: cage density and cage size during fattening, and breeding system and water quality on rabbit does

The aim of this work was to evaluate different management strategies to optimize rabbit production under chronic heat stress. To achieve it, three trials were conducted. In the first trial, to find the optimal cage density in tropical very dry forest condition, were measured growth performance, mortality rate, injured animals and carcass performance over an initial population of 300 cross-breed rabbits of New Zealand, California, Butterfly, Dutch and Satin, weaned at 30 days (535 ± 8 g, standard error). Treatments evaluated were: 6, 12, 18 and 24 rabbits/m2 (3, 6, 9 and 12 rabbits/cage, respectively, each cage of 0.5 m2). The maximal temperature-humidity index indicated a severe heat stress from weaning to 2.2 kg body weight (experimental time). At the end of experimental period 10, 20, 30 and 30 rabbits from the treatments of 6, 12, 18 and 24 rabbits/m2, respectively, were slaughtered and carcass performance recorded. Average daily gain and feed intake decreased by 0.31 ± 0.070 and 1.20 ± 0.25 g, respectively, per each unit that the density increased at the beginning of the experiment (P = 0.001). It increased the length of the fattening period by 0.91 ± 0.16 d (P = 0.001) per each unit of increment of density. However, rabbit production (kg/m2) increased linear and quadratically with the density (P < 0.008). Animals housed at the highest density compared to the lower one tended to show a higher incidence of ringworm (68.9 vs 39.4%; P = 0.075), injured animals (16.8 vs 3.03%; P = 0.12) and mortality (20.5 vs 9.63%; P = 0.043). The proportion of scapular fat (P = 0.042) increased linearly with increasing levels of density. Increasing density reduced linearly dorsal length (P = 0.001), and reduced linear and quadratically drip loss percentage (P = 0.097 and 0.018, respectively). In the second trial, 46 nulliparous rabbit does (23 clipped and 23 unclipped) with a BW of 3.67 ± 0.05 kg (s.e.) were used to evaluate heat stress and circadian rhythms comparing unclipped and clipped rabbit does, and to study if a more extensive breeding system increase litters performance at weaning without impairing rabbit doe performance,. Rectal temperature, feed and water 4 intake were recorded for 24 h. Rabbit does were mated 7 d after circadian measurements, and randomly assigned to two breeding systems. Control (C): mated at 14 d after parturition + litter weaned at 35 d of age. Extensive (E): mate at 21 after parturition + litter weaned at 42 d of age. The first three cycles were evaluated concerning to rabbit doe and litter performance. Two hundred twenty eight weaned rabbits, were divided into two cage sizes: 0.5 and 0.25 m2 with same density (16 rabbit/m2) and growing performance was recorded. Farm and rectal temperatures were minimal and feed and water intake maximal during the night (P < 0.001). Unclipped rabbit does showed higher rectal temperature (P = 0.045) and lower feed intake respect to clipped does (P = 0.019) which suggest a lower heat stress in the latter. Kits weaned per litter was reduced by 33% (P=0.038) in C group. This reduction was more important in the 2nd and 3rd cycles compared to the first (P ≤ 0.054). Rabbit doe feed efficiency tended to decrease in E respect C group (P = 0.093), whereas it was impaired from the first to the third cycle by 48% (P = 0.014). Growing rabbits from the E group were heavier at weaning (by 38%. P < 0.001), showed a higher feed intake (+7.4%) and lower feed efficiency (-8.4%) throughout the fattening period (P ≤ 0.056) respect to C group. Cage size had minor influence in growing performance. In the third trial, forty five non pregnant and non lactating rabbit does (21 nulliparous and 24 multiparous) were assigned randomly to farm water and to potable water to study if a water quality improvement can affect positively rabbit doe response to heat stress during pregnancy and lactation. A transponder was implanted in each animal to record subcutaneous temperature at 07:30 and 14:30 h. Experimental period extended from pregnancy (with no lactation) to the next lactation (until day 28). Body temperature and milk production were recorded daily, and body condition, feed and water intake weekly. Water quality did not affect any trait (P ≥ 0.15). Pregnant rabbit does were classified as does that weaned (W: 47%), not weaned (NW: 44%) or those pregnant that did not deliver (NB: 9%). Body temperature and feed intake decreased during pregnancy (P ≤ 0.031), but water intake remained constant. In this period body temperature decreased with metabolic weight (P ≤ 0.009). In W and NW does, 5 from mating to birth energy and protein balance impaired (P≤0.011). Body temperature of W does tended to be the lowest (P ≤ 0.090). Pregnancy length and total number of kits born tended to be longer and higher in NW than in W does (P = 0.10 and 0.053, respectively). Kit mortality at birth and from birth to 14 d of lactation was high, being worse for NW than for W does (97 vs. 40%; P<0.001). Body temperature during lactation was maximal at day 12, and milk production increased it (P ≤ 0.025). . In conclusion, in our heat stress conditions densities higher than 18 rabbits/m2 (34 kg/m2) at the end of fattening, are not recommended despite cage size, gestation and lactation productivity impaired not only when lactation is extended and along successive reproductive cycles but also due to a reduced embryo/kit survival and finally water quality improvement did not attenuate negative effect of heat stress. RESUMEN El propósito de éste trabajo fue evaluar diferentes estrategias de manejo para optimizar la producción de conejos bajo estrés térmico. Para lo cual se desarrollaron tres experimentos. En el primer experimento, para encontrar el número óptimo de gazapos por m2 de jaula durante el cebo en condiciones de bosque muy seco tropical, se estudiaron los rendimientos durante el cebo, mortalidad, animales lesionados y rendimiento de la canal sobre una población inicial de 300 conejos mestizos de Nueva Zelanda, California, Mariposa, Holandés y Satin, destetados a los 30 días de edad (535 ± 8g, error estándar). Los tratamientos evaluados fueron: 6, 12, 18 y 24 conejos/m2 (3, 6, 9 y 12 conejos/jaula, respectivamente, en jaulas de 0.5 m2). Durante el período experimental (destete a 2.2 kg de peso vivo), se observaron valores de THI correspondientes con un estrés térmico severo (THI max. De 31 a 35). Al final del período experimental, 10, 20, 30, y 30 conejos de los tratamientos con densidades de 6, 12, 18 y 24 conejos/m2, respectivamente, fueron sacrificados y su canal fue valorada. El promedio de la ganancia diaria y el consumo de alimento disminuyeron en 0.31 ± 0.070 y 1.20 ± 0.25 g, respectivamente, por cada unidad de incremento en la densidad al inicio del experimento (P=0.001). Esto alargó el período de engorde en 0.91 ± 0.16 d (P=0.001) por cada unidad de incremento de la densidad. Sin embargo, la producción de conejos (kg/m2) aumentó lineal y cuadráticamente con la densidad (P<0.008). Los animales alojados en las mayores densidades en comparación con el resto tendieron a mostrar una mayore incidencia de tiña (68.9 vs 39.4%; P=0.075), de cantidad de animales heridos (16.8 vs 3.03%; P=0.12), así como de mortalidad (20.5 vs 9.63%; P=0.043). El aumento en la densidad aumentó linealmente la proporción de grasa escapular (P=0.042) y redujo linealmente la longitud dorsal (P=0.001), y lineal y cuadráticamente el porcentaje de pérdida por goteo (P=0.018). En el segundo experimento, 46 conejas nulliparas (23 rasuradas y 23 no rasuradas) con un peso vivo de 3.67 ± 0.05 kg (e.e.) fueron usadas para evaluar el estrés 8 térmico y los ritmos circadianos comparando conejas rasuradas o no, y estudiar si un sistema de crianza más extensivo mejora el desempeño de la camada al destete sin perjudicar la productividad de la coneja. Durante 24 h se midió la temperatura rectal, consumo de alimento y de agua. Las conejas fueron montadas 7 días después, y distribuidas en dos sistemas de crianza. El control (C): monta a 14 días posparto y destete a 35 d de edad. El extensivo (E): monta a 21 días posparto y destete a 42 d de edad. Se controló la productividad de la coneja y la camada durante los tres primeros ciclos. Doscientos veintiocho gazapos fueron distribuidos en dos tamaños de jaulas (0.5 y 0.25 m2) con la misma densidad (16 conejos/m2) y se controlaron sus rendimientos productivos. Durante la noche se observaron los valores mínimos para la temperatura ambiental y rectal, y los máximos para consumo de alimento y agua (P< 0.001). Las conejas no rasuradas mostraron mayor temperatura rectal (P=0.045) y menores valores de consumo de alimento con respecto a las conejas rasuradas (P=0.019), lo que sugiere un menor estrés térmico en las últimas. El número de gazapos destetados por camada se redujo en 33% (P=0.038) en el grupo C. Este comportamiento se acentuó en el 2do y 3er ciclo en comparación con el primero (P≤0.054). La eficiencia alimenticia de las conejas tendió a disminuir en el grupo E con respecto al grupo C (P=0.093), dicha tendencia se acentúa del primer al tercer ciclo en un 48% (P=0.014). Los gazapos en fase de crecimiento provenientes del grupo E fueron más pesados al momento del destete (en 38% P<0.001), mostrando un mayor consumo de alimento (+7.4%) y menor eficiencia alimenticia (-8.4%) a lo largo del engorde (P≤0.056) con respecto al grupo C. El tamaño de la jaula tuvo una mínima influencia en el comportamiento durante el crecimiento de éstos gazapos. En el tercer experimento, cuarenta y cinco conejas no gestantes ni lactantes (21 nulíparas y 24 multíparas) se les asignó al azar agua dos tipos de agua: común de la granja y agua potable, con el fin de estudiar si una mejora en la calidad del agua puede afectar positivamente la respuesta de la coneja al estrés térmico durante la gestación y la lactancia. Se les implantó un transponder para registrar la temperatura subcutánea a las 7:30 y a las 14:30 h. El período experimental se extendió desde la gestación (sin 9 lactancia) hasta la lactanción consecutiva (hasta los 28 días). La temperatura corporal y la producción de leche se controlaron diariamente, y la condición corporal, consumo de agua y alimento, semanalmente. La calidad del agua no afectó a ninguna variable (P≥0.15). Las conejas preñadas fueron clasificadas como conejas que destetaron (W: 47%), que no destetaron (NW:44%) o aquellas que no parieron (NB: 9%). La temperatura corporal y consumo de alimento disminuyeron durante la gestación (P≤0.031), mientras que el consumo de agua se mantuvo constante. La temperatura corporal descendió con el peso metabólico durante la gestación (P≤0.009). El balance de energía y proteína disminuyó desde la monta al parto para las conejas W y NW (P≤0.011). Durante la gestación la temperatura corporal tendió a ser menor en las conejas W (P≤0.090). La longitud de la gestación y el número total de gazapos nacidos tendieron a ser mayores en conejas NW que en conejas W (P=0.10 y 0.053, respectivamente). La mortalidad de los gazapos al parto y del parto a los 14 días de lactancia fue alta, siendo peor para las conejas NW que para las W (97 vs 40%; P<0.001). Durante la lactancia la temperatura corporal alcanzó su valor máximo para el día 12, y la producción de leche indujo un incremento en la misma (P≤0.025). En conclusión, en nuestras condiciones de estrés térmico y sin importar el tamaño de la jaula, no se recomiendan densidades mayores a 18 conejos/m2 (34 kg/m2) al final del engorde. La productividad de la gestación y la lactancia disminuyen cuando la lactancia es mayor y se suceden varios ciclos reproductivos seguidos. Esto se debe al efecto negativo del estrés térmico sobre la vitalidad y supervivencia del embrión/gazapo. La mejora de la calidad del agua atenuó el efecto negativo del estrés térmico. Las conejas más productoras parece que son aquéllas que consiguen manejar mejor el estrés térmico.

A new method for the identification of old-growth trees in National Forest Inventories: Application to Pinus halepensis Mill. stands in Spain

Old-growth trees play a very important role in the maintenance of biodiversity in forests. However, no clear definition is yet available to help identify them since tree age is usually not recorded in National Forest Inventories. To develop and test a new method to identify old-growth trees using a species-specific threshold for tree diameter in National Forest Inventories. Different nonlinear mixed models for diameter ? age were generated using data from the Spanish Forest Inventory in order to identify the most appropriate one for Aleppo pine in its South-western distribution area. The asymptote of the optimal model indicates the threshold diameter for defining an old-growth tree. Additionally, five site index curves were examined to analyze the influence of site quality on these models.

Influence of climate change on the flowering of temperate fruit trees

It is well known that winter chilling is necessary for the flowering of temperate trees. The chilling requirement is a criterion for choosing a species or variety at a given location. Also chemistry products can be used for reducing the chilling-hours needs but make our production more expensive. This study first analysed the observed values of chilling hours for some representative agricultural locations in Spain for the last three decades and their projected changes under climate change scenarios. Usually the chilling is measured and calculated as chilling-hours, and different methods have been used to calculate them (e.g. Richarson et al., 1974 among others) according to the species considered. For our objective North Carolina method (Shaltout and Unrath, 1983) was applied for apples, Utah method (Richardson et al. 1974) for peach and grapevine and the approach used by De Melo-Abreu et al. (2004) for olive trees. The influence of climate change in temperate trees was studied by calculating projections of chilling-hours with climate data from Regional Climate Models (RCMs) at high resolution (25 km) from the European Project ENSEMBLES (http://www.ensembles-eu.org/). These projections will allow for analysing the modelled variations of chill-hours between 2nd half of 20C and 1st half of 21C at the study locations.

Use of decision trees algorithm for the territorial logistic planning.

Data mining, and in particular decision trees have been used in different fields: engineering, medicine, banking and finance, etc., to analyze a target variable through decision variables. The following article examines the use of the decision trees algorithm as a tool in territorial logistic planning. The decision tree built has estimated population density indexes for territorial units with similar logistics characteristics in a concise and practical way.

Obtención de clones de alcornoque (Quercus suber L.) mediante embriogénesis somática: aplicación de medios líquidos y biorreactores en la sincronización de los procesos de desarrollo y maduración de los embriones

El alcornoque tiene un gran valor ambiental, como integrante de los ecosistemas forestales mediterráneos, e interés comercial por el valor de la bellota (alimentación del cerdo ibérico), el carbón, la madera y sobre todo por las aplicaciones industriales del corcho. Las posibilidades de mejora genética del alcornoque, como las de otras especies forestales, están limitadas por sus largos ciclos reproductivos y porque su propagación vegetativa mediante estaquillado solo es posible en estados muy juveniles. Por ello este sistema de propagación tiene muy poca, o ninguna, utilidad práctica en la mejora genética. La embriogénesis somática es la vía más apropiada para la clonación de muchas especies forestales y ha hecho posible el desarrollo a gran escala de plantaciones multivarietales de coníferas. En alcornoque es posible la regeneración completa de árboles adultos mediante embriogénesis somática. Con los protocolos actuales (en medio semisólido), los embriones se generan formando acúmulos y en la fase de multiplicación conviven embriones en distintos estados de desarrollo. Es un sistema asincrónico, con baja eficacia para la propagación en masa, que no elimina completamente las dificultades para el desarrollo de programas de mejora genética del alcornoque. En otras especies la utilización de medios líquidos ha mejorado: la sincronización, productividad de los cultivos, el manejo y reducido los costes de producción. Por ello el desarrollo de suspensiones embriogénicas de alcornoque se plantea como una vía para aumentar la eficacia de la propagación clonal a gran escala. En la presente tesis se desarrollan cultivos embriogénicos de alcornoque en medio líquido. El capítulo 3 aborda el establecimiento y mantenimiento de suspensiones, el capítulo 4 el desarrollo de una fase de proliferación en medio líquido y el capítulo 5 la utilización de sistemas de cultivo en medio líquido, estacionarios y de inmersión temporal, como vía para favorecer la maduración de los embriones somáticos. Para iniciar los cultivos en medio líquido se emplearon agregados de embriones tomados de la fase de proliferación en medio semisólido. Cuando estos agregados se inocularon directamente en medio líquido no se logró el establecimiento de las suspensiones. El establecimiento se consiguió empleando como inóculo las células y Resumen pequeños agregados embriogénicos, de tamaño comprendido entre 41 y 800 μm, desprendidas por agitación breve de los agregados de embriones. El mantenimiento se logró inoculando en baja densidad masas embriogénicas compactas de tamaño comprendido entre 0,8 y 1,2 mm. Estas suspensiones, muy heterogéneas, mantuvieron su capacidad de proliferación y de regeneración de embriones al menos durante diez subcultivos consecutivos. El protocolo de iniciación y mantenimiento, desarrollado inicialmente con un solo genotipo, fue eficaz cuando se probó sobre otros 11 genotipos de alcornoque. En la fase de proliferación se ensayaron tres tipos de envase y tres velocidades de agitación. La combinación envase × velocidad determinó el intercambio gaseoso, la disponibilidad de oxígeno y el estrés hidrodinámico. Los agregados embriogénicos de alcornoque crecieron incluso en condiciones de hipoxia no siendo la disponibilidad de oxígeno un factor limitante del crecimiento para tasas de trasferencia de oxígeno comprendidas entre 0,11 h-1 y 1,47 h-1. Por otra parte la producción de biomasa creció con el estrés hidrodinámico para valores de índice de cizalladura inferiores a 5 x 10-3 cm min-1. La mayor producción de biomasa se obtuvo con matraces Erlenmeyer de 100 ml y alta velocidad de agitación (160 rpm) mientras que la diferenciación de embriones se vio favorecida por bajas velocidades de agitación (60 rpm) asociadas con bajas disponibilidades de oxígeno. La posibilidad de madurar embriones de alcornoque en medio líquido se estudió utilizando sistemas de inmersión permanente y sistemas de inmersión temporal. En inmersión permanente no se diferenciaron embriones cotiledonares (posiblemente por hiperhidricidad). Los sistemas de inmersión temporal permitieron obtener embriones maduros en estado cotiledonar y capaces de regenerar plantas in vitro. Concentraciones de sacarosa superiores a 60 g l-1 y frecuencias de inmersión iguales o inferiores a una diaria, tuvieron efectos negativos para el desarrollo de los embriones somáticos. En los sistemas de inmersión temporal los parámetros físico-químicos del medio de cultivo se mantuvieron estables y no se observó ninguna limitación de nutrientes. No obstante, estos sistemas se vieron afectados por la evaporación que generó el flujo de aire necesario para desplazar el líquido en cada periodo de inmersión. Abstract ABSTRACT Cork oak is one of the most important tree species of the Mediterranean ecosystem. Besides its high environmental value has a great economic interest due to the sustainable production of acorns (to feed the Iberian pig) charcoal, timber and cork, which is a renewable natural product with various technological applications. As happens with other forest species, cork oak genetic improvement programs are limited by their long life cycles and because vegetative propagation by cuttings it´s only possible in very juvenile plants. Hence this propagation system is useless or has little practical use for breeding cork oak. Plant regeneration by somatic embryogenesis is the most suitable way for cloning many forest species, and it is the enabling technology which has allowed the establishment of large-scale conifer multi-varietal plantations. Clonal plant regeneration of mature cork oak trees can be achieved through somatic embryogenesis. Somatic embryos at different stages of development and forming clusters are produced during the multiplication phase with current protocols (using semisolid medium). This is an asynchronous low-efficient process not suitable for mass propagation, and therefore it does not solve the difficulties presented by cork oak breeding programs. Culture in liquid medium has been used with other species to improve: synchronization, yield, handling, and to reduce production costs. Thus the development of cork oak embryogenic suspension cultures is envisaged as a way to increase the efficiency of large scale clonal propagation. The thesis herein develops cork oak embryogenic cultures in liquid medium. In chapter 3 establishment and maintenance of suspension cultures are developed, chapter 4 studies proliferation phase in liquid medium and chapter 5 considers the use of different systems of culture in liquid medium, both stationary and temporary immersion, as a way to promote somatic embryos maturation. Clusters of embryos taken from proliferating cultures on semisolid medium were used to initiate the cultures in liquid medium. When these clusters were inoculated directly in liquid medium establishment of suspension cultures was not executed. However using, as initial inoculum, cells and cell aggregates with a size between 41 and 800 μm detached from these clusters of embryos, subjected to a brief shaking, suspension cultures could be established. Suspension maintenance was achieved by inoculating compact embryogenic Abstract clumps with a size between 0.8 and 1.2 mm at low density. The suspension cultures, very heterogeneous, retained both their proliferation and embryo regeneration capacity for at least ten consecutive subcultures. The initiation and maintenance protocol, initially developed with a single genotype, was effective when tested on 11 additional genotypes of cork oak. In proliferation phase three types of vessels and three different levels of agitation were assayed. The combination vessel × orbiting speed determined gas exchange, oxygen availability and hydrodynamic stress. Cork oak embryogenic aggregates grew even under hypoxia conditions; oxygen availability at transfer rates between 0.11 and 1.47 h-1 was not a limiting factor for growth. Furthermore the biomass production was increased with hydrodynamic stress when shear rate values were of less than 5 x 10-3 cm min-1. The highest biomass production was obtained with 100 ml Erlenmeyer flask and high stirring speed (160 rpm) while the differentiation of embryos was favored by low agitation speeds (60 rpm) associated with low oxygen availability. The possibility to mature cork oak somatic embryos in liquid medium was studied using both permanent immersion systems and temporary immersion systems. Cotyledonary embryos did not differentiate in permanent immersion conditions (probably due to hyperhydricity). Temporary immersion systems allowed obtaining mature cotyledonary embryos, which were able to regenerate plants in vitro. Sucrose concentrations above 60 g l-1 and immersion frequencies equal to or lower than one each 24 h had negative effects on somatic embryo development. Physicochemical parameters of the culture medium in temporary immersion systems were stable and showed no limitation of nutrients. However, these systems were affected by the evaporation generated by the airflow necessary to relocate the medium at each immersion period.

Water harvesting for young trees using Peltier modules powered by photovoltaic solar energy

Young trees transplanted from nursery into open field require a minimum amount of soil moisture to successfully root in their new location, especially in dry-climate areas. One possibility is to obtain the required water from air moisture. This can be achieved by reducing the temperature of a surface below the air dew point temperature, inducing water vapor condensation on the surface. The temperature of a surface can be reduced by applying the thermoelectric effect, with Peltier modules powered by electricity. Here, we present a system that generates electricity with a solar photovoltaic module, stores it in a battery, and finally, uses the electricity at the moment in which air humidity and temperature are optimal to maximize water condensation while minimizing energy consumption. Also, a method to reduce the evaporation of the condensed water is proposed. The objective of the system is to sustain young plants in drier periods, rather than exclusively irrigating young plants to boost their growth.

Automatic blood glucose classification for gestational diabetes with feature selection: decision trees vs neural networks

Automatic blood glucose classification may help specialists to provide a better interpretation of blood glucose data, downloaded directly from patients glucose meter and will contribute in the development of decision support systems for gestational diabetes. This paper presents an automatic blood glucose classifier for gestational diabetes that compares 6 different feature selection methods for two machine learning algorithms: neural networks and decision trees. Three searching algorithms, Greedy, Best First and Genetic, were combined with two different evaluators, CSF and Wrapper, for the feature selection. The study has been made with 6080 blood glucose measurements from 25 patients. Decision trees with a feature set selected with the Wrapper evaluator and the Best first search algorithm obtained the best accuracy: 95.92%.

Urban trees and atmospheric pollutants in big cities: Effects in Madrid

Una investigación sobre la mejora de la contaminación del aire (CA) por medio de arbolado urbano se realizó en Madrid, una ciudad con casi 4 M de habitantes, 2,8 M de vehículos y casi 3 M de árboles de mantenimiento público. La mayoría de los árboles estaban en dos bosques periurbanos. Los 650.000 restantes era pies de alineación y parques. Los taxones estudiados fueron Platanus orientalis (97.205 árboles), Ulmus sp. (70.557), Pinus pinea (49.038), Aesculus hippocastanum (22.266), Cedrus sp. (13.678) y Quercus ilex (1.650), de calles y parques. Muestras foliares se analizaron en diferentes épocas del año, así como datos de contaminación por PM10 de 28 estaciones de medición de la contaminación durante 30 años, y también la intensidad del tráfico (IMD) en 2.660 calles. La acumulación de metales pesados (MP) sobre hojas y dentro de estas se estimó en relación con la CA y del suelo y la IMD del tráfico. La concentración media de Ba, Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb y Zn en suelo (materia seca) alcanzó: 489,5, 0,7, 49,4, 60,9, 460,9, 12,8, 155,9 y 190,3 mg kg-1 respectivamente. Los árboles urbanos, particularmente coníferas (debido a la mayor CA en invierno) contribuyen significativamente a mejorar la CA sobre todo en calles con alta IMD. La capacidad de las seis sp. para capturar partículas de polvo en su superficies foliares está relacionada con la IMD del tráfico y se estimó en 16,8 kg/año de MP tóxicos. Pb y Zn resultaron ser buenos marcadores antrópicos en la ciudad en relación con el tráfico, que fue la principal fuente de contaminación en los árboles y suelos de Madrid. Las especies de árboles variaron en función de su capacidad para capturar partículas (dependiendo de las propiedades de sus superficies foliares) y acumular los MP absorbidos de los suelos. Las concentraciones foliares de Pb y Zn estuvieron por encima de los límites establecidos en diferentes sitios de la ciudad. La microlocalización de Zn mediante microscópico mostró la translocación al xilema y floema. Se detectaron puntos de contaminación puntual de Cu and Cr en antiguos polígonos industriales y la distribución espacial de los MP en los suelos de Madrid mostró que en incluso en zonas interiores del El Retiro había ciertos niveles elevados de [Pb] en suelo, tal vez por el emplazamiento la Real Fábrica de Porcelana en la misma zona hace 200 años. Distintas áreas del centro de la ciudad también alcanzaron niveles altos de [Pb] en suelo. Según los resultados, el empleo de una combinación de Pinus pinea con un estrato intermedio de Ulmus sp. y Cedrus sp. puede ser la mejor recomendación como filtro verde eficiente. El efecto del ozono (O3) sobre el arbolado en Madrid fue también objeto de este estudio. A pesar de la reducción de precursores aplicada en muchos países industrializados, O3 sigue siendo la principal causa de CA en el hemisferio norte, con el aumento de [O3] de fondo. Las mayores [O3] se alcanzaron en regiones mediterráneas, donde el efecto sobre la vegetación natural es compensado por el xeromorfismo y la baja conductancia estomática en respuesta los episodios de sequía estival característicos de este clima. Durante una campaña de monitoreo, se identificaron daños abióticos en hojas de encina parecidos a los de O3 que estaban plantadas en una franja de césped con riego del centro de Madrid. Dada la poca evidencia disponible de los síntomas de O3 en frondosas perennifolias, se hizo un estudio que trató de 1) confirman el diagnóstico de daño de O3, 2) investigar el grado de los síntomas en encinas y 3) analizar los factores ambientales que contribuyeron a los daños por O3, en particular en lo relacionado con el riego. Se analizaron los marcadores macro y micromorfológicos de estrés por O3, utilizando las mencionadas encinas a modo de parcela experimental. Los síntomas consistieron en punteado intercostal del haz, que aumentó con la edad. Además de un punteado subyacente, donde las células superiores del mesófilo mostraron reacciones características de daños por O3. Las células próximas a las zonas dañadas, presentaron marcadores adicionales de estrés oxidativo. Estos marcadores morfológicos y micromorfológicos de estrés por O3 fueron similares a otras frondosas caducifolias con daños por O3. Sin embargo, en nuestro caso el punteado fue evidente con AOT40 de 21 ppm•h, asociada a riego. Análisis posteriores mostraron que los árboles con riego aumentaron su conductancia estomática, con aumento de senescencia, manteniéndose sin cambios sus características xeromórficas foliares. Estos hallazgos ponen de relieve el papel primordial de la disponibilidad de agua frente a las características xeromórficas a la hora de manifestarse los síntomas en las células por daños de O3 en encina. ABSTRACT Research about air pollution mitigation by urban trees was conducted in Madrid (Spain), a southern European city with almost 4 M inhabitants, 2.8 M daily vehicles and 3 M trees under public maintenance. Most trees were located in two urban forests, while 650'000 trees along urban streets and in parks. The urban taxa included Platanus orientalis (97'205 trees), Ulmus sp. (70’557), Pinus pinea (49'038), Aesculus hippocastanum (22’266), Cedrus sp. (13'678 and Quercus ilex (1'650) along streets and parks. Leave samples were analysed sequentially in different seasons, PM10 data from 28 air monitoring stations during 30 years and traffic density estimated from 2’660 streets. Heavy metal (HM) accumulation on the leaf surface and within leaves was estimated per tree related to air and soil pollution, and traffic intensity. Mean concentration of Ba, Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb and Zn in topsoil samples (dry mass) amounted in Madrid: 489.5, 0.7, 49.4, 60.9, 460.9, 12.8, 155.9 and 190.3 mg kg-1 respectively. Urban trees, particularly conifers (due to higher pollution in winter) contributed significantly to alleviate air pollution especially near to high ADT roads. The capacity of the six urban street trees species to capture air-born dust on the foliage surface as related to traffic intensity was estimated to 16.8 kg of noxious metals from exhausts per year. Pb and Zn pointed to be tracers of anthropic activity in the city with vehicle traffic as the main source of diffuse pollution on trees and soils. Tree species differed by their capacity to capture air-borne dust (by different leaf surface properties) and to allocate HM from soils. Pb and Zn concentrations in the foliage were above limits in different urban sites and microscopic Zn revelation showed translocation in xylem and phloem tissue. Punctual contamination in soils by Cu and Cr was identified in former industrial areas and spatial trace element mapping showed for central Retiro Park certain high values of [Pb] in soils even related to a Royal pottery 200 years ago. Different areas in the city centre also reached high levels [Pb] in soils. According to the results, a combination of Pinus pinea with understorey Ulmus sp. and Cedrus sp. layers can be recommended for the best air filter efficiency. The effects of ozone (O3) on trees in different areas of Madrid were also part of this study. Despite abatement programs of precursors implemented in many industrialized countries, ozone remained the main air pollutant throughout the northern hemisphere with background [O3] increasing. Some of the highest ozone concentrations were measured in regions with a Mediterranean climate but the effect on the natural vegetation is alleviated by low stomatal uptake and frequent leaf xeromorphy in response to summer drought episodes characteristic of this climate. During a bioindication survey, abiotic O3-like injury was identified in foliage. Trees were growing on an irrigated lawn strip in the centre of Madrid. Given the little structural evidence available for O3 symptoms in broadleaved evergreen species, a study was undertaken in 2007 with the following objectives 1) confirm the diagnosis, 2) investigate the extent of symptoms in holm oaks growing in Madrid and 3) analyse the environmental factors contributing to O3 injury, particularly, the site water supply. Therefore, macro- and micromorphological markers of O3 stress were analysed, using the aforementioned lawn strip as an intensive study site. Symptoms consisted of adaxial and intercostal stippling increasing with leaf age. Underlying stippling, cells in the upper mesophyll showed HR-like reactions typical of ozone stress. The surrounding cells showed further oxidative stress markers. These morphological and micromorphological markers of ozone stress were similar to those recorded in deciduous broadleaved species. However, stippling became obvious already at an AOT40 of 21 ppm•h and was primarily found at irrigated sites. Subsequent analyses showed that irrigated trees had their stomatal conductance increased and leaf life-span reduced whereas their leaf xeromorphy remained unchanged. These findings suggest a central role of water availability versus leaf xeromorphy for ozone symptom expression by cell injury in holm oak.

Conductancia del mesófilo en especies forestales: implicaciones en la respuesta fotosintética a la disponibilidad de agua y luz

La fotosíntesis es el proceso biológico que permite la producción primaria y, por tanto, la vida en nuestro planeta. La tasa fotosintética viene determinada por la ‘maquinaria’ bioquímica y las resistencias difusivas al paso del CO2 desde la atmósfera hasta su fijación en el interior de los cloroplastos. Históricamente la mayor resistencia difusiva se ha atribuido al cierre estomático, sin embargo ahora sabemos, debido a las mejoras en las técnicas experimentales, que existe también una resistencia grande que se opone a la difusión del CO2 desde los espacios intercelulares a los lugares de carboxilación. Esta resistencia, llamada normalmente por su inversa: la conductancia del mesófilo (gm), puede ser igual o incluso superior a la resistencia debida por el cierre estomático. En la presente tesis doctoral he caracterizado la limitación que ejerce la resistencia del mesófilo a la fijación de CO2 en diversas especies forestales y en distintos momentos de su ciclo biológico. En la fase de regenerado, hemos estudiado tres situaciones ambientales relevantes en el mayor éxito de su supervivencia, que son: el déficit hídrico, su interacción con la irradiancia y el paso del crecimiento en la sombra a mayor irradiancia, como puede suceder tras la apertura de un hueco en el dosel forestal. En la fase de arbolado adulto se ha caracterizado el estado hídrico y el intercambio gaseoso en hojas desarrolladas a distinta irradiancia dentro del dosel vegetal durante tres años contrastados en pluviometría. Para cada tipo de estudio se han empleado las técnicas ecofisiológicas más pertinentes para evaluar el estado hídrico y el intercambio gaseoso. Por su complejidad y la falta de un método que permita su cuantificación directa, la gm ha sido evaluada por los métodos más usados, que son: la discriminación isotópica del carbono 13, el método de la J variable, el método de la J constante y el método de la curvatura. Los resultados más significativos permiten concluir que la limitación relativa a la fotosíntesis por la conductancia estomática, del mesófilo y bioquímica es dependiente de la localización de la hoja en el dosel forestal. Por primera vez se ha documentado que bajo estrés hídrico las hojas desarrolladas a la sombra estuvieron más limitadas por una reducción en la gm, mientras que las hojas desarrolladas a pleno sol estuvieron más limitadas por reducción mayor de la conductancia estomática (gsw). Encontramos buena conexión entre el aparato fotosintético foliar y el sistema hídrico debido al alto grado de correlación entre la conductancia hidráulica foliar aparente y la concentración de CO2 en los cloroplastos en distintas especies forestales. Además, hemos mostrado diferentes pautas de regulación del intercambio gaseoso según las particularidades ecológicas de las especies estudiadas. Tanto en brinzales crecidos de forma natural y en el arbolado adulto como en plántulas cultivadas en el invernadero la ontogenia afectó a las limitaciones de la fotosíntesis producidas por estrés hídrico, resultando que las limitaciones estomáticas fueron dominantes en hojas más jóvenes mientras que las no estomáticas en hojas más maduras. La puesta en luz supuso un gran descenso en la gm durante los días siguientes a la transferencia, siendo este efecto mayor según el grado de sombreo previo en el que se han desarrollado las hojas. La aclimatación de las hojas a la alta irradiancia estuvo ligada a las modificaciones anatómicas foliares y al estado de desarrollo de la hoja. El ratio entre la gm/gsw determinó la mayor eficiencia en el uso del agua y un menor estado oxidativo durante la fase de estrés hídrico y su posterior rehidratación, lo cual sugiere el uso de este ratio en los programas de mejora genética frente al estrés hídrico. Debido a que la mayoría de modelos de estimación de la producción primaria bruta (GPP) de un ecosistema no incluye la gm, los mismos están incurriendo en una sobreestimación del GPP particularmente bajo condiciones de estrés hídrico, porque más de la mitad de la reducción en fotosíntesis en hojas desarrolladas a la sombra se debe a la reducción en gm. Finalmente se presenta un análisis de la importancia en las estimas de la gm bajo estrés hídrico de la refijación del CO2 emitido en la mitocondria a consecuencia de la fotorrespiración y la respiración mitocondrial en luz. ABSTRACT Photosynthesis is the biological process that supports primary production and, therefore, life on our planet. Rates of photosynthesis are determined by biochemical “machinery” and the diffusive resistance to the transfer of CO2 from the atmosphere to the place of fixation within the chloroplasts. Historically the largest diffusive resistance was attributed to the stomata, although we now know via improvements in experimental techniques that there is also a large resistance from sub-stomatal cavities to sites of carboxylation. This resistance, commonly quantified as mesophyll conductance (gm), can be as large or even larger than that due to stomatal resistance. In the present PhD I have characterized the limitation exerted by the mesophyll resistance to CO2 fixation in different forest species at different stages of their life cycle. In seedlings, we studied three environmental conditions that affect plant fitness, namely, water deficit, the interaction of water deficit with irradiance, and the transfer of plants grown in the shade to higher irradiance as can occur when a gap opens in the forest canopy. At the stage of mature trees we characterized water status and gas exchange in leaves developed at different irradiance within the canopy over the course of three years that had contrasting rainfall. For each study we used the most relevant ecophysiological techniques to quantify water relations and gas exchange. Due to its complexity and the lack of a method that allows direct quantification, gm was estimated by the most commonly used methods which are: carbon isotope discrimination, the J-variable, constant J and the curvature method The most significant results suggest that the relative limitation of photosynthesis by stomata, mesophyll and biochemistry depending on the position of the leaf within the canopy. For the first time it was documented that under water stress shaded leaves were more limited by a reduction in gm, while the sun-adapted leaves were more limited by stomatal conductance (gsw). The connection between leaf photosynthetic apparatus and the hydraulic system was shown by the good correlations found between the apparent leaf hydraulic conductance and the CO2 concentration in the chloroplasts in shade- and sun-adapted leaves of several tree species. In addition, we have revealed different patterns of gas exchange regulation according to the functional ecology of the species studied. In field grown trees and greenhouse-grown seedlings ontogeny affected limitations of photosynthesis due to water stress with stomatal limitations dominating in young leaves and nonstomatal limitations in older leaves. The transfer to high light resulted in major decrease of gm during the days following the transfer and this effect was greater as higher was the shade which leaves were developed. Acclimation to high light was linked to the leaf anatomical changes and the state of leaf development. The ratio between the gm/gsw determined the greater efficiency in water use and reduced the oxidative stress during the water stress and subsequent rehydration, suggesting the use of this ratio in breeding programs aiming to increase avoidance of water stress. Because most models to estimate gross primary production (GPP) of an ecosystem do not include gm, they are incurring an overestimation of GPP particularly under conditions of water stress because more than half of An decrease in shade-developed leaves may be due to reduction in gm. Finally, we present an analysis of the importance of how estimates of gm under water stress are affected by the refixation of CO2 that is emitted from mitochondria via photorespiration and mitochondrial respiration in light.