Otimização de protocolo para análise de AFLP em Lolium multiflorum Lam.

ESTABELECIMENTO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE MOLECULAR DE AZEVÉM ANUAL COM MARCADORES AFLP. O uso de marcadores moleculares no manejo de bancos de germoplasma tem sido cada vez mais expressivo. Entre os diferentes tipos de marcadores moleculares, o AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism, apresenta algumas vantagens para uso na caracterização de recursos genéticos, como a detecção de grande número de bandas informativas por reação, com ampla cobertura do genoma e considerável reprodutibilidade, além de não necessitar de dados de seqüenciamento prévio da espécie para a construção de primers. Embora a análise de AFLP seja freqüentemente utilizada em estudos de variabilidade genética em diferentes espécies, o uso da técnica em Lolium multiflorum ainda é incipiente. Com a finalidade de estabelecer um protocolo para o emprego da técnica de AFLP em azevém anual foi conduzido este trabalho. Foram avaliadas as concentrações iniciais de DNA genômico de 100 e 250 ng, a digestão do DNA com 1,25 e 1U das enzimas EcoRI e MSe, e os respectivos tempos de reação de digestão: 3, 6 e 12 horas. Também foram avaliadas quatro concentrações da solução resultante da ligação dos adaptadores: solução sem diluição; diluída 1:5; 1:10 e 1:20 e duas diluições após a reação de pré-amplificação, de 1:25 e 1:50. Como resultado, foi estabelecido como melhor protocolo, no qual foi obtido um maior número e qualidade de fragmentos, o que utiliza a concentração inicial de DNA genômico de 100 ng, num volume final de reação de digestão 10 ?l, com 1U de cada enzima EcoRI e MseI e tempo de reação de 12h a 37°C, com reação de ligação de adaptadores realizada com a adição da solução de ligação de adaptadores, do Kit AFLP? Analysis System I (InvitroGen Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA), e 0,4 U de T4 DNA ligase em um volume final de 10?l, por 2h a 20°C. Após a ligação de adaptadores a diluição deverá ser de 1:5. A reação de pré-amplificação deverá ocorrer a partir de 1?l desta última solução (diluída 1:5), 1,0 X PCR buffer com Mg Plus [Tris-HCl (pH 7.6) 20 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM], BSA 0,003% e 1 U de Taq DNA polimerase, completando com mix de pré-amplificação do Kit AFLP? Analysis System I até alcançar o volume final de 11?l. O produto da pré-amplificação deverá ser diluído 1:25 antes de ser procedida à amplificação seletiva, a qual deve ser realizada utilizando 2,5 ?l da solução de DNA pré-amplificado (diluído 1:25), 1 X PCR buffer com Mg Plus [Tris-HCl (pH 8,4) 20 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM], BSA (0,003%), 1 U de Taq DNA polimerase, 10 ng de primer EcoRI, 1,5 ng de primer MseI, 0,4mM de DNTps e H2O MilliQ? até completar o volume final de 10?l. Com este protocolo uma única combinação de primers permitiu identificar 58 bandas polimórficas na análise de duas populações de azevém anual.

Círculo de hospedeiras de isolados de Verticillium dahliae obtidos de tomteiro, quiabeiro e morangueiro.

O gênero Verticillium apresenta duas importantes espécies de fitopatógenos (V. dahliae e V. albo-atrum). A capacidade de produção de microescleródios dos isolados de V. dahliae em cultura tem sido empregada como a principal característica para distinção destas duas espécies. Verticillium dahliae é um fungo bastante polífago, amplamente disseminado no território brasileiro, causando murcha vascular em tomate, berinjela, jiló, algodão, morango, cacau, quiabo, dentre outras hospedeiras. Verticillium dahliae apresenta especialização fisiológica em tomateiro tendo sido descritas duas raças. O presente trabalho teve por objetivo investigar a capacidade de isolados de V. dahliae em infectar e causar doença em plantas de diversas famílias botânicas. Para avaliação da gama de hospedeiros, quatro isolados do fungo foram inoculados em 62 acessos de 54 espécies em 40 gêneros e 18 famílias botânicas. A maioria dos acessos mostrou-se susceptível ao patógeno. Foram classificadas como plantas não-hospedeiras todas as gramíneas avaliadas, as solanáceas Datura stramonium, Nicandra physaloides e Physalis ?oridana, couve-flor (linhagem CNPH-003), melancia (cv. Crimson Sweet), melão (cv. Eldorado 300) alface (cvs. Regina e Robinson), cenoura, feijão, soja-verde, beterraba, maracujá azedo (Passi?ora edulis), capuchinha (Trapaeolum majus) e cariru (Talinum triangulare). Foram identificadas 27 novas hospedeiras experimentais de V. dahliae.