Mecanismos de neurotoxicidade induzidos pela Dopamina e pela 6–OH-dopamina num modelo celular humano: efeito da presença de extratos de algas com elevada capacidade antioxidante

O aumento da esperança média de vida tem elevado a prevalência de doenças neurodegenerativas, como é o caso da doença de Parkinson. Nos últimos anos a procura de novas soluções terapêuticas, assim como a minimização dos efeitos dos tratamentos atualmente utilizados tem promovido a procura de novas soluções. Deste modo, o objetivo deste trabalho consistiu no estudo dos mecanismos moleculares de neurotoxicidade induzidos pela dopamina (DA) e 6-hidroxidopamina (6-OHDA) num modelo celular do neuroblastoma humano (SH-SY5Y), bem como na avaliação do potencial neuroprotetor de extratos de algas com elevada capacidade antioxidante. O efeito neurotóxico da DA e 6-OHDA, assim como o efeito protetor dos extratos das algas com maior atividade antioxidante (Sargassum muticum, Saccorhiza polyschides, Padina pavonica, Codium tomentosum, Ulva compressa) foi avaliado através da viabilidade celular das células SH-SY5Y utilizando o método de MTT. De modo a compreender os efeitos induzidos na viabilidade celular pela DA e 6-OHDA procedeu-se ao estudo da atividade da caspase-3, alterações do potencial mitocondrial e quantificação de H2O2. Os resultados demonstraram um claro efeito dependente da concentração da DA (30-3000μM) e 6-OHDA (10-1000μM) na viabilidade celular das células SH-SY5Y, bem como do tempo de exposição (6-48h). No que diz respeito a prevenção do efeito neurotóxico da DA (1000μM (56,41±5,05% de células viáveis); 24h) e 6-OHDA (100μM (66,76±3,24% de células viáveis);24h) pelos extratos das algas (1mg/mL; 24h) verificou-se que os extratos que apresentaram um efeito preventivo mais marcado pertencem as algas Sargassum muticum (82,37±6,41% de células viáveis e 115,8±8,53% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (89,26±8,62% de células viáveis e 106,51±4,26% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e Codium tomentosum (81,28±3,68% de células viáveis e 103,17±7,25% de células viáveis, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). A morte celular induzida pela DA e pela 6-OHDA foi acompanhada pelo aumento da atividade da caspase-3 quando comparado com o controlo (DA - 66,46±1,49fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto; 6-OHDA - 22,56±1,71fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto; controlo – 4,8 ±0,48fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto), pela presença de elevadas quantidades de peróxido de hidrogénio (H2O2) (363,81±28,58 % do controlo e 214,26 ± 8,46 % do controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e pela despolarização da membrana mitocondrial (162,3±2,34 % do controlo e 144,7±2,87 % do controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). Por sua vez, durante o tratamento com extratos das algas (1mg/mL) na presença de DA e 6-OHDA verificou-se uma inibição da atividade da caspase-3 induzida pelas algas Sargassum muticum (2,53±2,49fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto e 4,52±1,36 fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (4,71±0,70fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto e 2,73±1,11 fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente) e Codium tomentosum (17,05±1,72fluorescência (u.a.)/mg de proteína/minuto e 2,58±1,77fluorescência (u.a)/mg de proteína/minuto, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). De igual modo verificou-se uma diminuição da produção de H2O2 pelas células SH-SY5Y na presença dos extratos das algas Sargassum muticum (132,58 ± 10,68% controlo), Saccorhiza polyschides (150,54 ± 23,54% controlo) e Codium tomentosum (54,074 ± 6,66% do controlo), quando expostas a 6-OHDA, contudo não se verificou o mesmo efeito na presença de DA. Relativamente ao potencial mitocondrial observou-se uma inibição da despolarização mitocondrial induzida pela DA e 6-OHDA nas células SH-SY5Y pela presença dos extratos das algas Sargassum muticum (135,7±2,97% controlo e 49,3±1,17% controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente), Saccorhiza polyschides (126,7±5,46% controlo e 94,3±1,70% controlo, após tratamento com DA e 6-OHDA, respetivamente). Os resultados obtidos demonstraram o potencial citoprotetor dos extratos de algas sobre efeitos neurotóxicos induzidos pela DA e 6-OHDA no modelo celular SH-SY5Y. O efeito protetor é mediado pela diminuição da condição de stress oxidativo, com redução da produção de H2O2, diminuição da atividade da caspase-3 e prevenção da alteração do potencial mitocondrial induzido pela DA e 6-OHDA. Conclui-se que os extratos de algas produzem moléculas bioativas com elevado potencial antioxidante, podendo ser uma fonte promissora de novos compostos neuroprotetores com aplicação terapêutica para doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson.

Estudo sobre os mecanismos de combate à utilização indevida do contrato de prestação de serviço em relações de trabalho subordinado

A investigação que doravante se apresenta tem como objetivo a análise dos mecanismos de combate à utilização indevida do contrato de prestação de serviço em relações de trabalho subordinado, e está estruturada em duas partes distintas, a que correspondem dois capítulos. A primeira parte é dedicada aos problemas inerentes ao contrato de trabalho e ao contrato de prestação de serviço, mormente, a delimitação entre as duas figuras, detendo-nos em particular na questão da determinação da subordinação jurídica. A semelhança entre os aludidos contratos aumenta, na prática, a dificuldade de delimitação entre ambos. A presunção de laboralidade assume um papel fundamental na ajuda necessária no seu campo de atuação. De facto, a presunção de laboralidade tende a facilitar a prova, conforme veremos. O método indiciário e o método tipológico podem ser utilizados na delimitação dos elementos do contrato de trabalho. O método tipológico ajuda a procurar elementos que apontem que aquele contrato é ou não um contrato de trabalho, este método usado pelos tribunais, apesar de adequado, não resolve o problema daquelas relações jurídicas que se encontram na fronteira, também conhecida como “zona cinzenta”. No que toca ao método indiciário este tem como objetivo procurar indícios da existência de subordinação jurídica para, assim, se poder afirmar a existência de um contrato de trabalho. Os indícios não são elementos determinantes da existência de um contrato de trabalho, pelo que, por não existir um indício, não significa automaticamente que não exista um contrato de trabalho. Os indícios devem ser analisados todos em conjunto, para se aferir se existe ou não subordinação jurídica. Na segunda parte, estabelecemos como comando investigativo o estudo dos mecanismos de combate à utilização indevida do contrato de prestação de serviço em sentido amplo, no que concerne a relações de trabalho subordinado. Para tal analisaremos o estado da arte antes e depois da Lei nº 63/2013, de 27 de agosto. A ação de reconhecimento da existência de contrato de trabalho é inovadora no sentido em que já não caminha em direção ao interesse egoístico do trabalhador, mas sim tendo em conta o interesse público, conforme melhor veremos. É pela novidade do tema, que optamos por entrevistar pessoalmente profissionais, que estejam de alguma forma ligados a esta realidade, e que com a sua experiência contribuíram, e muito, para alicerçarmos as nossas conclusões. Para tal, iniciamos os nossos trabalhos, entrevistando Tiago Gillot, no dia 22-01-2015 e 14-10-2015 em representação da Associação “Precários Inflexíveis,” que encabeçou o movimento de cidadãos nesta iniciativa legislativa que deu corpo à Lei nº 63/2013, de 27 de agosto, o Dr. Jorge Pinhal, em representação da ACT, que nos recebeu no dia 02-02-2015, o Ministério Público representado pela Exma. Procuradora Dra. Cristina Faleiro, no dia 08-04-2015. Entrevistamos por escrito o Exmo. Sr. Dr. António Ramos, Juiz do TRP, no dia 14-10-2015. Por fim, tentaremos de acordo com o estudo desenvolvido apresentar algumas medidas contributivas no combate à utilização indevida do contrato de prestação de serviço, assente sobretudo no plano de emergência social, apresentado pela Associação do Combate à precariedade, que consideramos apaziguar o flagelo que se instalou nas relações laborais e ao que parece dificilmente sairá da nossa linha de preocupação.