Uso de espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por matriz : tempo de voo (MALDI-TOF MS) para formação de bibliotecas e caracterização da ocupação nodular em soja por estirpes de Bradyrhizobium

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2016.

A região do Cerrado é uma das mais importantes quanto ao cultivo da soja (Glycine max) no Brasil. Em 2014/2015, 28 milhões de hectares foram cultivados com esse grão no Cerrado. Um dos fatores responsáveis pela expansão da soja é a sua capacidade de nodular e fixar nitrogênio eficientemente em simbiose com bactérias do gênero Bradyrhizobium que foram recomendadas na forma de inoculantes contendo ao menos uma de quatro estirpes (CPAC7, CPAC15, SEMIA 587 e 29W), resultando em uma economia anual de cerca de 8 bilhões de dólares. Ao serem introduzidas e estabelecidas nos solos do Cerrado, essas bactérias podem competir pelos sítios de infecção nodular nas raízes com as estirpes utilizadas no inoculante. As populações estabelecidas podem ser mais competitivas e menos eficientes na fixação biológica de nitrogênio (FBN). Essa competição com populações estabelecidas capazes de nodular a soja pode gerar dúvidas quanto ao benefício da reinoculação. Portanto, estudos que elucidem a ocupação por diferentes estirpes vêm sendo desenvolvidos utilizando ferramentas analíticas em nível molecular, incluindo a espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF MS). Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi implementar uma biblioteca de MALDI-TOF MS, no intuito de aplicar uma metodologia rápida e eficaz para identificação diferenciada das estirpes capazes de nodular a soja. Após a construção dessa Biblioteca foi realizado foi realizado um estudo no sexto ano de um ensaio de longa duração que consistiu na introdução de bradirizobios em um solo de primeiro cultivo. Avaliando a capacidade competitiva e a ocupação nodular nesse experimento. A biblioteca suplementar foi validada estatisticamente e se mostrou eficaz na distinção das estirpes de Bradyrhizobium. A técnica de MALDI-TOF MS foi bem sucedida na identificação de isolados de campo em nível de estirpes. A reinoculação garantiu a persistência na ocupação nodular das estirpes CPAC 7 e CPAC 15 avaliadas. A estirpe CPAC 15 é mais competitiva que as demais. A ausência de reinoculação abre espaço para a infecção de bactérias oportunistas que não são provenientes dos inoculantes. __________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Cerrado region is one of the most important in the production of soybeans (Glycine max) in Brazil. In 2014/2015, 28 million hectares were planted with this crop in the Cerrado. One of the factors responsible for the expansion of soybean is its ability of nodulating and fixing nitrogen efficiently in symbiosis with Bradyrhizobium that was recomended as 4 strains (CPAC 7, CPAC 15, SEMIA 587 and 29W), resulting in annual savings of about 8 billion dollars. To be introduced and established in Cerrado soils, these bacteria can compete for nodular infection sites in the roots with the strains used in the inoculant. Established populations can be more competitive and less efficient in biological nitrogen fixation (BNF). This competition with established populations that nodulates soybean may raise doubts as to the benefit of re-inoculation. Therefore, studies elucidating the occupation by different strains have been developed, using analytical tools in molecular level, including mass spectrometric ionization and desorption by matrix assisted laser - time of flight ( MALDI-TOF MS ). Thus the objective of this work was to build, implement and validate an additional library of MALDI-TOF MS, in order to ensure the differentiated identification of strains capable of nodule soybeans and identify through this technique strains from the soybean nodules, originating in the sixth year of a long-term trial that introduce bradirhizobias on a soil. In order to assess the competitiveness and nodular occupation in this experiment seeking to determine their impact on the response of these crops to re-inoculation. The additional library was statistically validated and proved effective in distinguishing strains of Bradyrhizobium. MALDI-TOF MS technique was successful in identifying field level isolated strains. The re-inoculation ensures persistence in nodular occupation of strains CPAC 7 and CPAC 15. The strain CPAC 15 is more competitive than the others. The absence of re-inoculation makes room for the infection of opportunistic bacteria that are not from the inoculants.