Screening natural resources for mineralogenic and osteogenic bioactivities using in vitro and in vivo fish systems

Dissertação de Mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016

Bone disorders affect millions of people worldwide, and available treatments have only a limited efficacy and/or bring undesirable side effects. There is therefore the need for novel compounds with bone anabolic properties. Due to its technical advantages, fish have been successfully used in biomedical and pharmaceutical research to screen for osteogenic compounds. The aim of this work was to evaluate mineralogenic/osteogenic performance of semi-purified fractions and purified molecules from terrestrial plants (cardoon and eucalyptus) and cyanobacteria. VSa13 cell line established from gilthead seabream (Sparus aurata) vertebra and capable of in vitro mineralization was used to assess the mineralogenic potential of the extracts, while zebrafish operculum was used to develop and establish a reliable in vivo model to screen molecules for osteogenic activity. Extracts from cardoon, eucalyptus and some cyanobacteria exhibited some moderate mineralogenic effect while triterpenic acids purified from eucalyptus strongly increased mineral deposition. Pro-mineralogenic compounds were further analysed for their bone anabolic action on zebrafish operculum and lipophilic cardoon extract, ursolic acid, oleanolic acid and ethyl acetate fraction of cyanobacteria strain #13 were found to promote an osteogenic effect. While the osteogenicity of ursolic acid has already been reported in mouse, the action of oleanolic acid and cyanobacteria extract on bone formation is revealed here for the first time. The use of a double transgenic line expressing fluorescent proteins under the control of osterix/sp7 and osteocalcin/oc2 promoters to get insights into mechanisms underlying the osteogenic activity of natural compounds has been explored. In vitro and in vivo data generated within the scope of this work have not only demonstrated the potential of natural resources to provide molecules with mineralogenic/osteogenic activity that may be used in pharmaceuticals or nutraceuticals but also the suitability of fish systems to screen for these molecules.

O tecido ósseo é um tipo especializado de tecido conjuntivo constituído por células e por uma matriz extracelular, que possui como característica única a capacidade de promover a sua mineralização,, o que confere a este tecido uma extrema dureza, permitindo-lhe desempenhar importantes funções quer de suporte mecânico aos músculos, possibilitando o movimento, quer de proteção de órgãos internos, constituindo também uma reserva de iões de cálcio e de fosfato. As patologias mais importantes que afectam o esqueleto incluem doenças metabólicas, que afectam o crescimento através de alterações na formação e remoção óssea, fracturas, deformações várias,, infecções bacterianas e tumores. Entre as doenças metabólicas que afectam milhões de pessoas em todo o mundo e que resultam do desequilíbrio entre a atividade osteoblástica (formação óssea) e a atividade osteoclástica (reabsorção óssea) estão a osteoporose, a osteopetrose, o raquitismo e a doença óssea de Paget. No entanto os tratamentos usados são ineficazes e/ou estão associados a efeitos secundários indesejáveis existindo a necessidade de descobrir novos compostos com a capacidade de reverter os sintomas dessas patologias no osso. Os recursos naturais representam uma fonte valiosa de moléculas bioativas, em particular de compostos osteogénicos. A análise em grande escala de extratos ou moléculas com potenciais efeitos osteogénicos requer o uso de ferramentas in vitro e in vivo optimizadas Organismos aquáticos como o peixe-zebra (zebrafish) têm sido utilizados com sucesso nas investigações biomédica e farmacêutica devido às suas vantagens técnicas em relação a modelos animais mais clássicos, como o ratinho. Por exemplo o peixe-zebra possui um ciclo de vida mais curto, gera um elevado número de descendentes, tem o genoma sequenciado, os embriões são transparentes e desenvolvem-se externamente. Além disso, os peixe-zebra adultos também podem ser facilmente visualizados e manipulados experimentalmente e existem mutantes/transgénicos que permitem a análise da expressão de multiplos genes através de microscopia de fluorescência. O objectivo principal deste trabalho é avaliar a capacidade mineralogénica/osteogénica de fracções semi-purificadas e de moléculas purificadas de plantas terrestres, como o cardo ou o eucalipto, e de cianobactérias. A linha celular VSa13 obtida a partir de vértebras de dourada (Sparus aurata), que possui a capacidade de mineralização in vitro, foi usada para analisar o potencial mineralógenico dos extratos usados, e o opérculo do peixe-zebra foi usado para desenvolver e estabelecer um modelo in vivo adequado para analisar os efeitos de moléculas com atividade osteogénica (através do uso do calcitriol). Os nossos resultados demostraram a existência de um efeito mineralogénico moderado usando concentrações não tóxicas de extratos de cardo, de eucalipto e de algumas cianobactérias, enquanto que ácidos triterpénicos purificados a partir de amostras de eucalipto (como por exemplo o ácido betulónico, ursólico e oleanólico) aumentam até 6 vezes a deposição de mineral na matrix extracelular da linha celular VSa13. Os nossos resultados mostraram ainda que in vitro, a cinaropicrina, uma lactona sesquiterpénica abundante nos extratos de cardo, promovia um efeito anti-mineralogénico, o que foi mais tarde comprovado utilizando o nosso modelo in vivo. O efeito de compostos pro-mineralogénicos foi posteriormente analisado através do estudo do opérculo do peixe-zebra e os nossos resultados demonstraram que os extratos lipofílicos do cardo, como o ácido ursólico, o ácido oleanólico e a fracção de acetato de etílo da espécie #13 de cianobactérias, possuem efeitos osteogénicos. Apesar da capacidade osteogénica do ácido ursólico já ter sido analisada e comprovada por outros grupos usando um modelo animal de ratinho, a ação do ácido oleanólico, da cinaropicrina e de extratos de cianobactérias na formação óssea nunca tinha sido descrita. O uso de uma linha de duplos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente sob o controlo dos promotores do osterix/sp7 ou da osteocalcina/oc2 tem sido determinante para tentar perceber os mecanismos responsáveis por esta atividade osteogénica e sendo a mesma abordagem atualmente aplicada ao estudo do efeito dos ácidos triterpenicos. Os dados gerados a partir das ferramentas in vitro e in vivo utilizadas neste trabalho não só demonstraram o potencial de recursos naturais (terrestres ou marinhos) para a descoberta de moléculas com efeito mineralogénico/osteogénico potencialmente relevantes para as indústrias farmacêutica ou alimentar, como também evidenciaram a importância do uso de animais modelos como o peixe-zebra para a análise do efeito destas moléculas.