Enhancement of non-viral transfection efficiency with nuclear localization signal peptides

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016

A terapia génica envolve a transferência de material genético terapêutico para células alvo, pela introdução de genes funcionais que substituam ou complementem aqueles que se encontram defeituosos, com o objectivo de tratar ou prevenir uma ampla gama de doenças, hereditárias ou adquiridas. No entanto, para o seu sucesso é necessário um sistema de entrega de material genético eficiente, capaz de proteger o DNA da degradação por nucleases e com o mínimo de toxicidade e imunogeneicidade que permita uma expressão genética estável e duradoura. Durante os últimos anos, têm sido desenvolvidos uma ampla gama de vectores, que têm sido divididos e caracterizados como vectores virais e não virais. Os vectores virais apresentam maior eficiência na transferência de material genético, tanto in vitro como in vivo, no entanto apresentam algumas limitações como a reduzida capacidade de empacotamento genético e o facto de conduzirem a respostas inflamatórias/imunológicas indesejáveis que consequentemente limitam administrações subsequentes. Por sua vez, os vectores não virais apresentam algumas vantagens sobre os vectores virais, nomeadamente, um perfil imunológico mais seguro, uma produção mais fácil, uma maior capacidade de empacotamento genético e a sua reduzida toxicidade. Contudo, o uso de vectores não virais é limitado devido às suas eficiências de transfecção relativamente baixas, marcadas pela baixa translocação nuclear, e consequentemente reduzida expressão genética. Vários esforços têm sido realizados no sentido de ultrapassar a barreira nuclear, um dos maiores passos limitantes no desenvolvimento de sistemas de entrega genética não virais eficazes. Uma das estratégias passa pela incorporação de sinais de localização nuclear em complexos poliméricos, uma vez que estes péptidos catiónicos ao serem reconhecidos pelas importinas permitem um transporte genético eficaz para o núcleo através dos complexos de poros nucleares, aumentando assim a entrega nuclear do DNA, e por consequente, a sua expressão genética. Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi a caracterização e optimização de vectores não virais, baseados em polímeros como o quitosano e o ácido hialurónico, que foram escolhidos devido às suas notórias propriedades de biocompatibilidade, biodegradação e ausência de toxicidade. Péptidos baseados em sinais de localização nuclear endógenos, pertencentes á família dos IGFBP, derivados nomeadamente do IGFBP-3 e IGFBP-5, foram avaliados com o intuito de melhorar a translocação nuclear sem comprometer o perfil imunológico bastante baixo dos vectores não-virais. Várias estratégias foram testadas para avaliar a eficiência de transfecção e a expressão genética mediada por poliplexos de quitosano e ácido hialurónico em células HEK293T: nomeadamente a co-administração, a co-complexação e a ligação covalente dos péptidos IGFBP aos poliplexos de quitosano. Os nossos resultados mostraram que as nossas formulações, com ou sem sulfato de sódio, péptidos IGFBP ou ácido hialurónico, e independentemente da estratégia usada, originaram poliplexos com um intervalo de tamanhos entre 250 nm e 750 nm e carga de superfície positiva, caracterizados através de medições no Zetasizer. Os nossos poliplexos foram ainda capazes de complexar o DNA de forma eficaz, conforme analisado através de ensaios de electroforese em gel de agarose. Posteriormente à caracterização dos poliplexos, os péptidos IGFBP foram ainda avaliados quanto á sua citotoxicidade em dois períodos de incubação, 24 horas e 72 horas. Os ensaios de viabilidade celular não mostraram qualquer citotoxicidade para ambos os péptidos IGFBP para as várias concentrações testadas nos dois períodos de tempo testados. Após estes resultados, e uma vez que os poliplexos apresentaram características desejáveis quanto ao seu tamanho, carga de superfície e complexação eficiente do DNA, estes foram avaliados quanto à sua eficácia através de ensaios de transfecção in vitro, analisados posteriormente por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. A eficiência de transfecção revelou-se ser dependente da concentração dos péptidos IGFBP e variar consoante o método de entrega utilizado. Nos ensaios de transfecção, utilizando o método de co-administração dos poliplexos com os péptidos IGFBP, nenhum aumento na eficiência de transfecção foi observado. Nos métodos em que estratégias como a co-complexação e a ligação covalente dos péptidos IGFBP aos poliplexos de quitosano foram usadas, um aumento significativo da eficiência de transfecção foi conseguido, no entanto, apenas para os poliplexos associados ao IGFBP-3. Uma possível explicação para estes resultados é o facto de as acessibilidades e/ou afinidades para com as subunidades das importinas diferirem entre os péptidos IGFBP-3 e IGFBP-5, o que consequentemente, poderá levar a níveis de translocação diferentes entre os péptidos, no entanto, ainda não é claro qual o mecanismo. Foi ainda possível verificar que combinando polímeros como o quitosano e o ácido hialurónico, que os poliplexos resultantes renderam um aumento significativo da eficiência de transfecção para ambos os péptidos, IGFBP-3 e IGFBP-5, o que poderá ser explicado por uma possível modificação no enrolamento das cadeias do quitosano aquando da adição do ácido hialurónico. Na sua globalidade os resultados obtidos demonstraram que, apesar de ser ainda necessário uma optimização da eficiência de transfecção, poliplexos co-complexados com péptidos IGFBP são de facto bons candidatos a sistemas de entrega genética não virais. Os poliplexos com dois polímeros combinados, quitosano e ácido hialurónico, foram os que revelaram maiores eficiências de transfecção, para ambos os péptidos, IGFBP-3 e IGFBP-5. Futuramente, seria interessante não só expandir a gama de concentrações de péptidos IGFBP testadas como também o tipo de linhas celulares, compreendendo ainda uma optimização das formulações dos poliplexos.

Gene therapy entails the transfer of therapeutic genetic material into specific cells; however, their success requires an efficient gene delivery system, which allows a stable gene expression. Nuclear import is considered the major limiting step in the development of effective non-viral gene delivery systems; the incorporation of NLS that can mediate nuclear intake can be used as a strategy in order to enhance the internalization of DNA into the nucleus. In this work, an endogenous NLS peptide, based on IGFBP, namely IGFBP-3 and IGFBP-5, was evaluated in order to ameliorate nuclear translocation without compromising the fairly low immunological profile of non-viral vectors. Several strategies were tested to determine their effect in chitosan and acid hyaluronic polyplex-mediated transfection efficiency in HEK293T cells: co-administration, co-complexation, and covalent ligation to chitosan polyplexes. Our results show that our vectors are capable of an effective DNA complexation and present size and surface charge appropriated for gene delivery applications. Transfection efficiency is concentration dependent and varies with the delivery method employed. Co-complexation and covalent ligation of IGFBP peptides to chitosan polyplexes yielded a 2-fold increase in transfection efficiency associated with the use of IGFBP-3 peptides. The incorporation of acid hyaluronic yielded a significant increase in transfection efficiency to both peptides. Despite of the improvements in transfection efficiency it needs to be further improved, these results indicate that polyplexes co-complexed with IGFBP peptides are good candidates for non-viral gene delivery systems and would be interesting to expand the range of tested IGFBP peptides concentrations as well as the type of cell lines used.