Avaliação de métodos de deteção de genótipos de cianobactérias produtoras de cianotoxinas em amostras ambientais

Dissertação de Mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016

As cianobactérias, bactérias aquáticas fotossintéticas, têm a capacidade de formar densas florescências, conhecidas como “Cyanobacteria Harmful Algal Blooms” (CyanoHABs). Estes levam ao decréscimo da qualidade da água, pela acumulação de escumas superficiais e por originarem eventos tóxicos, visto que muitas espécies podem produzir substâncias nocivas biologicamente ativas (cianotoxinas). As cianotoxinas, como cilindrospermopsina (CYN) e saxitoxina (STX), têm uma vasta gama de mecanismos de toxicidade, como efeitos hepatotóxicos, neurotóxicos, citotóxicos e genotóxicos. Este grupo de moléculas pode ser quantificado por métodos de ELISA, HPLC ou LC-Ms/Ms, métodos que devido ao elevado custo comprometem a sua utilização regular em processos de monitorização. A presença no fitoplâncton de espécies toxigénicas pode ser detetada através de genes especificamente associados à produção de toxinas. Por exemplo, a biossíntese de CYN é codificada por genes do grupo (cluster) cyr e a de STX depende do cluster de genes sxt. Por outro lado, vários autores têm referido a sensibilidade de alguns bioindicadores, utilizados em avaliação ecotoxicológica, como Thamnocephallus platyurus e Daphnia magna a estes agentes químicos de stress. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer uma associação entre ferramentas toxicológicas e a deteção de genótipos toxigénicos, cyr e stx, no sentido de avaliar os riscos ambientais associados aos CyanoHABs, de uma forma mais rápida e economicamente viável. Usou-se DNA extraído a partir de amostras ambientais frescas e preservadas, e de isolados de culturas, testando diferentes primers específicos para cyr ou sxt na amplificações de fragmentos daqueles genes. A presença de amplicões específicos para estes genes foi comparada com os dados ecotoxicológicos obtidos. Sendo a deteção transcriptómica da expressão destes operões ainda demasiado dispendiosa, e não garantindo a presença de genes a sua expressão, a associação das ferramentas ecotoxicológicas à deteção de genótipos toxigénicos parece ser um procedimento eficaz para ajudar a prever riscos associados a CyanoHABs.

Cyanobacteria are aquatic photosynthetic bacteria that may form dense blooms, known as Cyanobacteria Harmful Algal Blooms (CyanoHABs). These decrease water quality, may accumulate surface scums and originate toxicity events, since many species can produce harmful, biologically active substances. Cyanotoxins, like cylindrospermopsins (CYN) or saxitoxins (STX), may be quantified through ELISA assays, HPLC or LC-Ms/Ms, methods that lack cost effectiveness for regular use in toxicity screening. Such toxins have a wide range of toxicity mechanisms, with hepatotoxic, neurotoxic, cytotoxic and even genotoxic effects, and may thus be detected through the use of ecotoxicological assays. In fact, assays testing Thamnocephalus platyurus mortality or the inhibition of mobility and/or reproduction of Daphnia magna are known to successfully detect CYN and SXT toxicity. The presence of toxigenic species may also be assessed through the screening for toxin production genes among phytoplankton DNA. CYN biosynthesis is encoded by the cyr gene cluster and STX depends on the sxt gene cluster. Toxigenic genera, producing either CYN or STX have been detected in many environments. Thus, the main goal of this work was to evaluate the association of ecotoxicological tools with the detection of toxigenic cyr or stx genotypes, in order to assess environmental risks linked to CyanoHABs. We used DNA extracted from fresh and preserved environmental samples, as well as from cultured isolates in PCR amplification, testing different sets of specific primers for cyr or stx. The presence of specific amplicons for these genes was compared with acquired ecotoxicological data. While transcriptomic detection of the expression of cyr or sxt operons is still not cost effective, and gene detection doesn‟t guarantee their actual expression, the association of ecotoxicological tools to the detection of toxigenic genotypes seems the most effective procedure to help predict risks linked to toxicity of CyanoHABs events.