Investigating the role and function of Tribbles 2 (TRIB2) in drug resistance within cancer

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

O cancro é uma das maiores causas de morte em tudo o mundo e é causado por um série de alterações somáticas no DNA que, consequentemente, causam uma proliferação celular descontrolada. A grande maioria destas alterações são causadas por erros aquando da replicação, por defeitos no processo de reparação do DNA ou pela exposição a cancerígenas. Casualmente, as patologias cancerígenas podem ser causadas por uma alteração num gene dominante (oncogene), que estimula a que ocorra uma proliferação celular desregulada. Na sua grande maioria e, porventura, em todos os tipos de cancro que ocorrem nos humanos existem, como principais características dos mesmos, seis alterações essenciais à fisiologia das células: a autossuficiência no que diz respeito a sinais de crescimento, uma evidente insensibilidade a sinais inibitórios externos de crescimento, uma evasão à morte celular programada, um ilimitado potencial replicativo, uma angiogénese sustentada pela própria célula e uma capacidade metastática para outros tecidos do organismo. O Melanoma é a forma mais agressiva de cancro que se desenvolve a partir dos melanócitos e, ainda, uma das mais frequentes patologias oncológicas em diversos países. É mais comum em pessoas com idades compreendidas entre os 30 e os 60 anos e, o aumento anual no seu número de casos nos últimos cinco anos, tem causado um consequente significativo aumento na taxa de mortalidade associada a este tipo de cancro. Os Melanomas podem desenvolver-se em pessoas com todo o tipo de cor de pele, contudo existe uma maior incidência deste tipo de tumor em pessoas que possuam uma pele mais clara. Sendo esta uma patologia heterogénea, a mesma apresenta diferentes e diversas alterações genéticas e, ainda, uma extensa variedade de subtipos histológicos. Este tipo de doença oncológica é extremamente agressivo, conferindo, aos pacientes, um prognóstico pessimista. Tendo em conta o referido anteriormente, é de extrema importância que sejam descobertos novos alvos celulares e novas terapias contra esta doença cancerígena. Desta forma, a investigação científica nesta área tem sido vasta, obtendo-se, através de estudos recentes, resultados que demonstram que sinalização da PI3K está desregulada na grande maioria dos Melanomas. Atualmente, o composto químico BEZ235 tem demonstrado ser detentor de um significante potencial como agente anticancerígeno. A via de sinalização PTEN/PI3K/AKT é um importante regulador de diversos processos biológicos, como, por exemplo, o metabolismo, o crescimento celular, a proliferação celular e a apoptose. O PTEN é uma fosfatase com características de proteína e de lípido, e que tem, como principal substrato, o fosfatidil inositol 3,4,5-trifosfato (PIP3), que é o produto da PI3K. O aumento do níveis de PIP3 faz com que ocorra o recrutamento de AKT para a membrana, permitindo que o mesmo seja ativado por outras quinases que também são dependentes de PIP3. O TRIB2 é um gene que tem sido descrito como sendo um dos que demonstram possuir uma regulação superior em diversos tipos de cancro, inclusive em Melanomas, onde a sua sobre expressão proteica é um obstáculo à eficiência dos tratamentos aplicados a este tipo de patologia oncológica. Este mesmo gene, também tem sido implicado na regulação negativa da via de sinalização do FOXO, especialmente na regulação negativa do FOXO3a. Como consequência das características atrás mencionadas, o TRIB2 tem sido considerado como uma das causas para a resistência aos quimioterapêuticos clássicos (como o DTIC) e aos inibidores da PI3K (como o BEZ235), por parte de pacientes com Melanoma. Tendo em conta que a supressão da função do fator de transcrição FOXO é uma característica fundamental para inúmeras células tumorais, a regulação desses mesmos fatores tem sido, cada vez mais, uma das linhas de investigação mais seguidas contra o cancro. O BEZ235 é um potente inibidor das PI3Ks, as quais se encontram desregulamente ativas nos mais variados tipos de cancro, incluindo no Melanoma. Esta desregulação, tem como consequência a inativação da família dos fatores de transcrição FOXO, os quais exercem funções como reguladores cruciais do ciclo celular e da apoptose. Neste trabalho, foi investigado o processo sobre como o TRIB2 medeia a resistência aos inibidores da PI3K e, também, qual a função do FOXO3a em resposta a esse mesma resistência. No decorrer da investigação inerente a este trabalho, foi constatado que o TRIB2 exerce uma determinada influência sobre a apoptose, a nível da transcrição, contudo o mesmo não acontece sobre o ciclo celular. Posteriormente, também foi verificado que a sobre expressão de TRIB2 atenua, significativamente, a apoptose induzida pelo inibidor da PI3K BEZ235, tendo sido observado que, após o tratamento com esse mesmo inibidor, as células onde a expressão de TRIB2 estava presente, demonstraram possuir níveis proteicos de Caspase-3 clivada inferiores e que essas mesmas células são, fenotipicamente, caracterizadas por uma redução significativa na população celular na fase Sub-G1, comparativamente às células que não sobre expressam TRIB2. Neste trabalho, foi também verificado que a sobre expressão de TRIB2 confere resistência aos quimioterapêuticos, que induzem a apoptose, dependentes do supressor tumoral p53. Contudo, e em contraste com a exposição ao BEZ235, foi verificado que o tratamento com o quimioterapêutico convencional DTIC estabiliza o p53 nas células que sobre expressam TRIB2. Estes resultados indicam que o balanço celular proteico entre o p53 e o MDM2 está corrompido. Todos as evidências atrás verificadas foram realizadas em amostras in-vitro. Contudo, aquando da realização deste projeto, foi possível ter acesso a amostras de Melanoma e a amostras normais ex-vivo. Nas amostras de pacientes com Melanoma, foi verificado um aumento significativo nos níveis de AKT fosforilada, comparativamente às amostras normais. De acordo com a ativação da via do AKT referida acima, foi também verificado a existência de níveis altos de FOXO3a fosforilado nas células dos pacientes com Melanoma. Em concordância com as observações atrás mencionadas, foi verificado que as células normais expressam uma maior quantidade das proteínas reguladas pelo FOXO3a, FasL e BIM, comparativamente às células de pacientes com Melanoma. Estas observações podem ser devidas ao facto das células cancerígenas precisarem de evitar a apoptose, de forma a continuarem a divisão celular, particularmente no último estádio da doença. Por último, foi também constatado que, tanto a transcrição como a expressão proteica de TRIB2, estão ambas significativamente elevadas nas amostras de pacientes com Melanoma, comparativamente às amostras de células normais.