Functional analysis of a transcriptional variant of matrix gla protein (MGP)

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

Em Portugal, o adenocarcinoma do cólon apresenta uma taxa de prevalência em relação a outros tumores de 10%, e em média, morrem 9 a 10 pacientes por dia. Embora este tipo de tumor seja diagnosticado já numa fase mais avançada e sintomática da doença, com uma progressão em cerca de 10 anos, o prognóstico permanece reservado. Contudo, se diagnosticado num estadio mais precoce, a taxa de sobrevivência para um período de 5 anos apresenta valores acima dos 50%, tanto para homens como para mulheres. De acordo com os dados publicados pelo Registo Oncológico do Sul (ROR-Sul) 81% e 71% dos casos foram diagnosticados por volta dos 60 anos em homens e mulheres, respectivamente. Existem duas formas principais para o aparecimento do adenocarcinoma do cólon, nomeadamente, a forma relacionada com o aparecimento esporádico com origem em mutações em células somáticas (mais de 95% dos casos) e a forma associada à herança de mutações em células da linha germinal (forma hereditária). Associadas às mutações transmitidas através de células da linha germinal, temos a síndrome da polipose adenomatosa familiar (FAP) e o síndrome não polipoide hereditário ou síndrome de Lynch. No caso da síndrome adenomatosa familiar, esta é uma doença hereditária autossómica dominante, e é caracterizada por 1) aparecimento de milhares de tumores pré-neoplásicos (pólipos) ao longo de todo o tubo digestivo e 2) aparecimento numa idade jovem (40 anos). Associada a esta doença está também o gene supressor de tumores APC, responsável maioritariamente pela proliferação celular e activação de vias de sinalização apoptóticas. Quando existe uma perda por heterozigotia (LOH) do restante alelo funcional este síndrome tem maior risco de vir a dar origem a um adenocarcinoma. Existem ainda outros tipos de síndromes associados a este tipo e doença, nomeadamente, a síndrome de Gardner, a hipertrofia congénita do pigmento da retina e a forma mais suave da polipose adenomatosa familiar. Em relação à síndrome de Lynch esta difere da FAP pelo tipo de mutações encontradas em genes associados a mecanismos de reparação do ADN como é o caso do MLH1 e MSH2 e por não apresentar pólipos pré-neoplásicos em grande número. Já a forma do adenocarcinoma do cólon esporádico, está relacionado com o aparecimento de mutações pontuais em células somáticas, que podem ser causadas por fatores subjacentes ao dia-a-dia do paciente. No entanto é de salientar que para ambas as formas de manifestação do adenocarcinoma do cólon, é necessário ocorrer um primeiro evento carcinogénico que altere o normal funcionamento da célula. No que diz respeito aos métodos de rastreio para este tipo de tumores, os melhores continuam ainda a ser a sigmoidoscopia e colonoscopia total. No entanto, o avanço das técnicas em biologia molecular tem vindo a permitir a descoberta de novos genes que estejam envolvidos na regulação tumoral e que no futuro possam ser considerados possíveis biomarcadores para uma deteção mais precoce e possíveis alvos terapêuticos, a fim de diminuir a mortalidade ainda associada a este tipo de tumores. A MGP (Proteína Gla da matrix) é uma proteína extracelular cuja principal função está associada à inibição da calcificação das artérias e cartilagem. No cancro, embora tenha sido demonstrada uma sobre-expressão da MGP numa variedade de tumores, como o cancro do ovário, da mama, glioblastomas, entre outros, o seu papel permanece pouco claro,. Especificamente, no adenocarcinoma do cólon foi anteriormente demonstrada uma desregulação da MGP, embora de forma pouco consistente. Como tal o principal objetivo deste trabalho incidiu sobre a análise de expressão do gene MGP, bem como a análise de alguns possíveis fatores de transcrição associados à sua regulação em amostras do adenocarcinoma do cólon. Para tal, amostras de mucosa normal e tumoral de 20 pacientes foram analisadas por PCR em tempo real. Os resultados demonstraram haver uma forte tendência para a sobre-expressão da MGP a nível do mRNA (P= 0.056) em biópsias do adenocarcinoma do cólon em comparação com as biópsias de mucosa normal, contrariando resultados anteriores indicando uma regulação negativa feste gene. Os resultados aqui apresentados são no entanto consistentes com uma elevada expressão da MGP (níveis idênticos aqueles que foram observados na mucosa tumoral das amostras dos pacientes com adenocarcinoma do colon) Tendo em conta estes resultados, procedeu-se então à análise da expressão de fatores de transcrição que têm sido descritos na literatura como tendo um papel na regulação da MGP e em alguns casos também na tumorigénese. Dos resultados obtidos, constatou-se um aumento da expressão dos genes do RUNX2 (p = 0,037) e CCBE1 (p = 0,012) em amostras de adenocarcinoma do cólon. Para os genes do FGF2 (p = 0,085) e RARa (p = 0,58) os resultados não apresentaram valores estatisticamente significativos. No entanto, verificou-se que existia uma correlação de Pearson positiva (r = 0,89, p≤0.0001 para o FGF2 e r = 0,85 , p ≤0.0001 para o RARa), demonstrando assim uma forte tendência para o aumento da regulação simultânea desses fatores de transcrição e da MGP. Em suma, a MGP encontra-se sobre expressa nas amostras no adenocarcinoma do cólon, no entanto não é possível estabelecer quais os mecanismos de regulação que estão a ser desregulados e se um pior prognóstico poderá estar associado a esta desregulação. Para isso, será necessário no futuro realizar i) uma análise mais alargada em número de pacientes, e ii) uma análise mais profunda sobre como esses genes interagem entre si. Será também importante analisar quais os efeitos de um bloqueio da expressão da MGP na linha celular de adenocarcinoma de cólon, bem como testar os efeitos dos fatores de transcrição identificados no promotor da MGP.