Bloqueio meiótico como alternativa para aumentar a produção de embriões clone por transferência nuclear

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016.

O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito do bloqueio meiótico utilizando inibidores da fosfodiesterase do tipo 3A (PDE 3A) na produção de embriões clones. Para tanto, foram realizados dois experimentos utilizando dois inibidores da retomada da meiose: cilostamida, um inibidor específico da Fosfodiesterase do tipo 3 (PDE3A), e o Peptídeo Natriurético do tipo C (NPPC), um sinalizador para liberação de guanilato ciclase (cGMP) que bloqueia atividade da PDE3A. Ovócitos provenientes de ovários de abatedouro foram divididos em dois grupos para cada experimento: Controle (maturação por 20 horas) e Pré-Maturados (PM) por 6 horas com 5 μM de cilostamida ou 100 nM de NPPC e, posteriormente maturados por 20 horas. Os ovócitos foram avaliados quanto à cinética de maturação nuclear e desenvolvimento embrionário na produção in vitro de embriões (PIVE) e na clonagem por TNCS e, número total de células. Para a avaliação da Transferência Nuclear com Células Somáticas (TNCS) em cada tratamento, foi adicionado um grupo controle que foi ativado partenogeneticamente (PA). Os resultados foram avaliados pelo teste de Chi-quadrado e Kruskal-Wallis com P<0.05 considerado como significativo. No primeiro experimento, em que a PM foi realizado com 5μM de cilostamida, aproximadamente 87,8% dos ovócitos submetidos à Pré- maturação se mantiveram em estágio de Vesícula Germinativa (VG) após 6 horas de PM, confirmando o bloqueio meiótico. Quanto ao desenvolvimento embrionário na PIVE, não houve diferença (P>0,05) entre os grupos controle e PM quanto à taxa de clivagem em D2 (78,2% e 76,9%) e Blastocisto em D7 (35,5% e 29,3%). No desenvolvimento embrionário após a TNCS, a PM não afetou a taxa de clivagem em D2 dos grupos controle e PM respectivamente (66% e 51,9%), mas causou uma redução (P<0,05) na taxa de blastocisto em D7 (7,4% e 30,2%, respectivamente). No segundo experimento, foi utilizado NPPC para a PM dos ovócitos, sendo que após 6 horas de PM 84,9% estavam em estágio de VG. Quanto ao desenvolvimento embrionário na PIVE, os grupos controle e PM apresentaram taxa de clivagem em D2 (76,4% e 77,8%) e de blastocisto em D7 (48,3% e 45,6%) semelhantes (P>0,05). Na clonagem por TNCS, não houve diferença (P>0,05) na taxa de clivagem (69,2% e 68,4%) e de blastocisto (24,4% e 21,5%) entre o PM e controle. Os embriões clones e PA dos grupos PM e controle não diferiram quando ao número total de células (P>0,05). Concluise que a PM por 6 horas com 100 nM de NPPC é viável para a produção de embriões clones sem efeito deletério na qualidade e nas taxas de produção. _____________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

This study aimed to evaluate the effect of meiotic arrest using phosphodiesterase type 3A (PDE 3A) inhibitors in the production of clones embryos. Two experiments were performed using two inhibitors of meiotic resumption: cilostamide, a specific inhibitor of phosphodiesterase type 3 (PDE3A), and natriuretic peptide type C (NPPC), a peptide that induces the production of guanylate cyclase (cGMP ) that blocks the activity of PDE3A. Oocytes obtained from slaughterhouse ovaries were divided into two groups for each experiment: control (maturation for 20 hours) and Pre-Maturarion (PM) for 6 hours with 5μM of cilostamide or 100 nM of NPPC and then maturation for 20 hours. The oocytes were evaluated for nuclear maturation, embryonic development after in vitro embryo production (IVP),and after SCNT, and total cells number. For SCNT evaluation in each treatment a control group that was activated parthenogenetically (PA) was added. The results were evaluated by Chi-square and Kruskal-Wallis test with P <0.05 considered significant. In the first experiment, where the PM was carried out with 5μM of cilostamide, approximately 87.8% of the oocytes that have undergone PM remained at germinal vesicle stage (GV) after 6 hours of PM, confirming the meiotic block. Embryo development in IVP was similar (P> 0.05) between control and PM, either for cleavage rate on D2 (78.2% and 76.9%) or blastocyst rate on D7 (35, 5% to 29.3%). After SCTN, cleavage rate on D2 was also similar (P>0.05) between control and PM (66% and 51.9%) however, blastocyst rate on D7, was much lower (P<0.05) in PM than on control group (7.4% and 30.2%). In the second experiment, NPPC was used for 6 hours of PM. After PM approximately 84.9% of the oocytes remained at VG stage. Results of IVP showed no difference between control and PM on cleavage (76.4% and 77.8%) and blastocyst rates (48.3% and 45.6%). Similarly, no diferences between PM and control groups were observed for cleavage (69.2% and 68.4%) and blastocyst (24.4% and 21.5%) rates. SCNT and PA embryos from control or PM oocytes showed no diferences in the total cell number. It can be concluded that PM for 6 hours with 100nM NPPC is feasible for embryos cloned production without deleterious effect on the outcome and embryo.