Validation d’un procédé automatisé d’extraction sur phase solide de glandes digestives de moules pour l’identification et la quantification des dinophysistoxines en LC/ESI/SM2 par piégeage d’ions quadripolaire

This report presents a new extraction method of the dinophysistoxins (DTXs), confirmed by quantification using high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with an ion trap and electro spray interface (HPLC/ESI/MS2). The method originality consists on the adaptation of DTXs basic extraction procedure (liquid/ liquid) to a solid phase extraction (SPE) via a robotic station: ASPEC XLi The parameters of the automatization procedure were optimized to obtain the best DTXs recovery rate. These improvements were loaded with digestive gland mussel homogenat realized on a silica cartridge SPE, activated in hexane/chloroform (50:50), washed with hexane/chloroform (50:50) and extracted by an elution gradient (chloroform methanol (65:35) and methanol (100%)). This method was validated according to two normative referentials (linearity, detection quantification limits and accuracy…) : - The Guide of the Pharmacy industry: Analytical Validation, report of the commission SFSTP 1992 (French Corporation of the Sciences and Technical Pharmaceutical), - - The Procedure of validation of an alternative method in compare to a reference method. (AFNOR, 1998. NF V 03-110). Comparison with the classical liquid/liquid extraction and the automated method present clear advantages. In an analytical method the extraction is generally considered to be the most labor-intensive and error-prone step. This new procedure allowed us to increase throughput, to improve the reproducibility and to reduce the error risks due to the individual manual treatments.

Ce rapport présente une nouvelle méthode d’extraction des dinophysistoxines (DTXs), vérifiée par quantification sur chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse à piégeage d'ions via une interface électrospray (HPLC/ESI/MS2). L’originalité de cette méthode repose sur l’adaptation d’une procédure classique d’extraction des DTXs (liquide/liquide) à une extraction automatisée (ASPEC Xli) sur phase solide. Les paramètres de la procédure d’automatisation ont été optimisés pour obtenir un rendement d’extraction maximum des DTXs. Ces améliorations ont été réalisé à partir d’un homogénat de glandes digestives de moules chargé sur une cartouche de silice SPE, activée en hexane/chloroforme (50:50), lavée à l'hexane/chloroforme (50:50) et extraite par un gradient d’élution chloroforme/méthanol (65:35) et méthanol (100%). Cette méthode a été validée selon deux référentiels normatifs (linéarité, limites de détection et de quantification, exactitude…) : - Le Guide des industriels de la pharmacie : Validation Analytique, rapport de la commission SFSTP 1992 (Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques), - La Procédure de validation intralaboratoire d’une méthode alternative par rapport à une méthode de référence (AFNOR, 1998. NF V 03-110 ). En comparaison de l'extraction liquide /liquide classique, les avantages dues à l’automatisation de la préparation des échantillons sont évidents. En effet dans une méthode analytique, cette étape est généralement considérée comme la partie manuelle la plus longue et la plus fastidieuse et elle est aussi la plus sujette aux erreurs. Cette nouvelle procédure nous a permis d’augmenter la capacité de traitement des échantillons, d’améliorer la reproductibilité et de diminuer les risques d’erreur relatifs aux traitements individuels par une utilisation différente du matériel.