Vicilinas de sementes de leguminosas selvagens:purificação, caracterização, efeito de deletério e mecanismo de ação para bruquídeos e para fungos fitopatogênicos

Globulins fractions of legume seeds of Crotalaria pallida, Erytrina veluntina and Enterolobium contortisiliquum were isolated and submitted to assays against serine, cysteine and aspartic proteinases, as also amylase present in midgut of C. maculatus and Z. subfasciatus. Hemagglutination assays indicated presence of a lectin in E. veluntina globulin fractions. This lectin had affinity to human erythrocytes type A, B and O. Vicilins were purified by chromatography on Sephacryl S-300 followed of a chromatography on Sephacryl S-200, which was calibrated using protein markers. Vicilins from C. pallida (CpV) and E. veluntina (EvV) seeds had a molecular mass of 124.6 kDa and E. contortisiliquum a molecular mass of 151kDa. Eletrophoresis in presence of SDS showed that CpV was constituted by four subunities with apparent molecular mass of 66, 63, 57 and 45 kDa, EvV with three subunities with apparent molecular mass of 45kDa and EcV four subunities, two with 37.1 kDa and two with 25.8 kDa. Non denaturantig eletrophoresis displayed single bands with high homogeneity, where CpV had lower acidic behavior. All vicilins are glycoproteins with carbohydrate contents at 1 to1.5%. Bioassays were done to detect deleterious effects of vicilins against C. maculatus and Z. subfasciatus larvae. CpV, EvV and EcV exhibited a WD50 of 0.28, 0.19 and 1.03%; LD50 0.2, 0.26, and 1.11% respectively to C. maculatus. The dose responses of CpV, EvV and EcV to Z. subfasciatus were: WD50 of 0.12, 0.14, 0.65% and LD50 of 0.09, 0.1, and 0.43% respectively. The mechanism of action of these proteins to bruchids should be based on their properties of bind to chitin present in mid gut of larvae associated with the low digestibility of vicilin. In assays against phytopatogenous fungus, only EcV was capable of inhibit F. solani growth at concentrations of 10 and 20 µg and its action mechanism should be also based in the affinity of EcV to chitin present in the fungi wall

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Sementes de leguminosas das espécies Crotalaria pallida, Erythrina veluntina e Enterolobium contortisiliquum tiveram suas frações globulínicas isoladas. As globulinas não apresentaram atividade de inibidores para as enzimas tipo serínicas, cisteínicas, aspárticas e para as amilases de homogenatos intestinais de larvas de Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus. Os testes de atividades hemaglutinantes indicaram que apenas a globulina de Erytrina veluntina apresentou contaminação com lectinas com afinidade para eritrócitos humanos do tipo A, B e O. As vicilinas foram então purificadas usando-se duas cromatografias de filtração em gel, Sephacryl S-300 seguido de uma Sephacryl S-200 calibrada com marcadores de massa molecular conhecidos. Vicilinas de C. pallida (CpV) e E. veluntina (EvV) apresentaram massa molecular de 124,6 kDa e a de E. contortisiliquum (EcV) com massa molecular de 151 kDa..Eletroforese desnaturante mostrou que CpV possui 4 subunidades de massas moleculares aparentes de 66, 63, 57, 45 kDa; a de EvV com duas subunidades de massa molecular aparente de 66,2 e 63,8 kDa e EcV três subunidades de massa molecular aparente de 54,9 kDa. Essas proteínas mostraram ser homogêneas por eletroforese nativa com bandas únicas, onde CpV revelou ser a proteína menos ácida. Todas as vicilinas são glicoproteínas,com conteúdo de carboidrato variando de 1 a 1,5%. Bioensaios foram feitos para determinar o efeito deletério das vicilinas para C. maculatus e Z. subfasciatus. Cpv, EvV e EcV apresentaram WD50 de 0,28, 0,19 e 1,03%; LD50 de 0,2, 0,26 e 1,11% para C. maculatus, respectivamente . As curvas dose resposta para Cpv, EvV e EcV para Z. subfasciatus apresentou WD50 de 0,12, 0,14 e 0,65%; e LD50 de 0,09, 0,10 e 0,43%, respectivamente. Ensaios digestórios utilizando se enzimas dos intestinos médio de bruquídeos mostraram que as vicilinas são resistentes à proteólise, dentre elas destaca-se EcV, que mesmo depois de incubadas por 24 horas não foram hidrolisados pelas enzimas de de C. maculatus. Nos ensaios para fungos fitopatógenos apenas EcV foi capaz de inibir a germinação de esporos de Fusarium solani à concentração de 10 e 20 µg. O mecanismo de ação proposto para as vicilinas foi baseado na propriedade que essas proteínas tiveram de se ligarem a quitina ou estruturas quitinosas presentes nos intestinos médios das larvas associado à baixa digestibilidade destas proteínas para enzimas dos insetos