Purificação, caracterização e avaliação da atividade antiproliferativa de um inibidor de quimotripsina tipo kunitz de semente de Eryhrina velutina

A chymotrypsin inhibitor was purified from Erythrina velutina seeds by ammonium sulphate fractionation, affinities chromatographies on Trypsin-Sepharose, Quimotrypsin-Sepharose and reversed phase C-18 FPLC/AKTA system. The inhibitor, named EvCI, shown molecular mass of 17 kDa, as determined by SDSPAGE. 2D-PAGE showed four isoinhibitors with pI values of 4,42, 4,63, 4,83 and 5,06, with molecular mass of 17 kDa each. The aminoacid sequence of EvCI was determined by MALDI-TOF-MS and showed a high similarity with other Kunitz-type inhibitor of Erythrina variegata. EvCI competitively inhibited chymotrypsin, with Ki of 4 x10-8 M, but did not inhibited trypsin, pancreatic elastase, bromelain and papain. The inhibitory activity of EvCI was stable over wide pH and temperature ranges. In the presence of DTT 100 mM for 120 min, EvCI lost 50 % of activity. Cytotoxicity was studied in HeLa, MDA, HepG2, K562 and PC3 cells after 72-h incubation period. EvCl inhibited HeLa cells growth with an IC50 value of 50 μg/ml. Subsequent studies in HeLa cells analysis of cell death by annexin V/PI double-staining and cell cycle, using flow cytometry. The results provide evidence for a cytostatic activity of EvCl and support further studies on potential application of this inhibitors as an antiproliferative agent in combined therapy against cervical cancer

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Um inibidor de quimotripsina do tipo Kunitz foi purificado de sementes de Erythrina velutina por fracionamento com sulfato de amônio, cromatografias de afinidade Tripsina-Sepharose, Quimotripsina-Sepharose e cromatografia de Fase Reversa C- 18 no sistema FPLC/AKTA. O inibidor, denominado de EvCI, apresentou uma massa molecular de 17 kDa, determinada por SDS-PAGE. A análise por eletroforese bidimensional (2D) revelou quatro isoinibidores (valores de pI: 4,42, 4,63, 4,83 e 5,06). Todos os isoinibidores apresentaram massa molecular de 17 kDa. A sequência aminoacídica dos peptídeos oriundos da digestão enzimática de EvCI analisada por MALDI-TOF-MS apresentou 100% de identidade com o inibidor de quimotripsina ECl de Erythrina variegata. EvCI inibiu competitivamente a atividade de quimotripsina com Ki de 4 x10-8 M, mas não inibiu tripsina, elastase pancreática, bromelaína ou papaína. Contudo, inibiu elastase de neutrófilos em 35,91 %. A atividade inibitória de EvCI sobre quimotripsina foi estável em uma ampla faixa de pH e temperatura. Na presença de 100 mM de DTT por 120 min, o inibidor perdeu 50% de sua atividade. A citotoxicidade do inibidor foi avaliada nas linhagens de células HeLa, MDA, HepG2, K562 e PC3 após exposição a concentrações variando de 0,0005 a 200 μg/mL, por 72 horas. O EvCl inibiu o crescimento celular de células HeLa com um IC 50 de 50 μg/mL. Os resultados obtidos na avaliação de indução de morte celular e efeitos sobre o ciclo celular em células HeLa, indicam que o principal efeito do inibidor é a indução de parada do ciclo celular, sendo, portanto, citostático. Os dados sugerem que o EvCl pode ser um composto promissor para ser estudado no futuro como agente citostático na terapia antitumoral combinada