Identificação dos produtos de oxidação de glicosfingolípidos por espectrometria de massa

O stress oxidativo está associado ao envelhecimento e a inúmeras patologias, nomeadamente a doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, e a diversos outros fatores. O stress oxidativo leva à oxidação de importantes biomoléculas como os lípidos e, ao contrário da maior parte dos produtos de oxidação de fosfolípidos e ácidos gordos insaturados (PUFAS), os produtos de oxidação de glicosfingolípidos (GSLs) têm sido escassamente estudados. Os glicosfingolípidos são moléculas muito diversificadas estruturalmente e com importantes funções, essencialmente no sistema nervoso central (SNC) onde estão localizados maioritariamente. Deste modo, alterações na estrutura dos GSLs conduzirão a consequente comprometimento das suas funções e ao possível desenvolvimento de patologias. Assim para identificar as modificações oxidativas que ocorrem em glicosfingolípidos e pressupor consequentes efeitos biológicos nas células sob stress oxidativo, prepararamse sistemas modelo biomiméticos com diferentes GSLs os quais foram expostos a radicais hidroxilo gerados sob condições da reação de Fenton (H2O2 e Fe2+) e as reações foram monitorizadas por diferentes metodologia utilizando a espectrometria de massa. Os resultados obtidos com este estudo permitiram-nos identificar vários produtos de oxidação produzidos durante a oxidação desta classe de lípidos. Os produtos de oxidação observados em comum, em todos os GSLs estudados (C16:0GalCer, C24:1GalCer, C24:1LacCer e GM1) foram as suas correspondentes ceramidas. Estas atuam como agentes pro-apoptóticos e podem in vivo promover a neurodegeneração nas células sob stress oxidativo. Também foi possível observar produtos com inserção de oxigénio junto às duplas ligações ou na cadeia de esfingosina (no caso do GM1) ou na cadeia de ácido gordo monoinsaturada (no caso da C24:1GalCer, C24:1LacCer), corroborando o facto de que ácidos gordos saturados não são susceptíveis à oxidação por radicais. Interessantemente em ambos os GSLs de cadeias glicosiladas compostas com mais de um açúcar (C24:1LacCer e GM1) observou-se a despolimerização oxidativa da porção glicosilada por quebra das correspondentes ligações glicosídicas. Esta degradação leva à formação de GlcCer no caso de oxidação de LacCer ou na formação de outros gangliósidos (GM2, GM3, asialoGM1 e asialoGM2) e glicolípidos (LacCer e GlcCer), no caso de oxidação de GM1. A formação por via radicalar não enzimática destes GSLs leva a distúrbios no perfil lipídico. Previamente, em certas doenças, foram observadas variações na concentração do perfil de gangliósidos e de ceramidas. Estes dados permitem sugerir que em células em condições de stress oxidativo, a acumulação de gangliósidos mais simples e ceramidas poderá ter uma contribuição de produtos da degradação oxidativa dos gangliósidos e GSLs mais complexos. Este trabalho contribui assim para uma melhor compreensão das modificações estruturais que ocorrem em alguns glicosfingolípidos em condições de stress oxidativo. Os produtos de oxidação aqui identificados suportam a sua possível futura deteção em sistemas biológicos.

The oxidative stress is associated with aging, with many pathologies, including neurodegenerative and cardiovascular diseases and with several other factors. Oxidative stress leads to oxidation of important biomolecules such as lipids. Unlike most of the phospholipids and unsaturated fatty acid (PUFAS) oxidation products, the glycosphingolipids oxidation products have been scared addressed. The glycosphingolipids (GSLs) are a class of lipids with high structural diversity and have important functions, namely in central nervous system (SNC) where are major components. Thus, alterations in GSLs structure will lead to consequent impairment of its functions and the possible development of pathologies. In this context, for identify the oxidative modifications that occurs in glycosphingolipids and presumed consequent biologic effects in cells under oxidative stress, biomimetic model systems with different GSLs were used and exposed to hydroxyl radical produced under Fenton reaction conditions (H2O2/Fe2+), the reactions were monitored by mass spectrometric techniques. The obtained results allowed to identify several oxidation products generated during the oxidation this lipidic class. Ceramides were detected as oxidation products for all studied of GSLs (C16:0GalCer, C24:1GalCer, C24:1LacCer and GM1). Interestingly, ceramides are pro-aptotic agents, so can be promote neurodegeneration in vivo in cells under oxidative stress. Also it was possible to observe products formed by the addition of with oxygen atoms in the vicinity of the double bond whether in sphingosine backbone (in case of GM1) or in monounsaturated fatty acid chain (in case of C24:1GalCer and C24:1LacCer), corroborating the hypothesis that saturated fatty acids don’t are susceptible the radicalar oxidation. Interestingly, in both GSLs with glycosylated chains composed with more of one sugar (C24:1LacCer and GM1) it was possible to observe the oxidative depolymerization of glycan linked to ceramide through of cleavage of the correspondents glycosidic bonds. It allowed us to suggest that in cells under oxidative stress, where previously were observed variations in concentration of normal content of the gangliosides and ceramides namely in certain neurodegenerative diseases, it is possible that change sin GSL profile can be have the contribution of oxidative stress. In fact, this contribution can be associated with the non-enzymatic oxidative degradation of more complexes gangliosides in simple gangliosides and ceramides. This work contributes to a better understanding of the fate of some glycosphingolipids under conditions of oxidative stress. The oxidation products here identified supports their possible future detection in biological systems.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica