Kisspeptina: efeito na maturação in vitro de ovócitos bovinos

This study aimed to evaluate different concentrations of kisspeptin, as well as the interaction of kisspeptin and FSH/LH in vitro maturation and oocyte competence in cattle. In Experiment 1 was determined the minimum concentration of Kisspeptin (Kp) to be used, and in Experiment 2 was evaluated its interection with FSH and LH. The oocytes were collected in a commercial slaughterhouse and only Grade I oocytes were utilized. The oocytes were cultured in TCM-199 medium with bicarbonate plus 10% FBS, sodium pyruvate (22μg/mL), amikacin (83mg/mL), FSH (0.5μg/mL), with different concentrations of Kp, the treatments were: FSH + 0M Kp-10; FSH + 10-7M Kp-10, FSH + 10-6M Kp-10; FSH + 10-5M Kp-10. In Experiment 2, was used better concentration of Kp found in Experiment 1, the following treatments: no hormones; FSH; FSH + Kp-10; FSH + LH; FSH, LH + Kp-10; Kp-10. The oocyte competence was determined by nuclear maturation, mitochondrial distribution, MitoTracker® Orange CMTMRos fluorescence intensity and DCF. The evaluation of nuclear maturation was made after 24 hours incubation and the oocytes were stained with DAPI to determine the nuclear stage (Germinal Vesicle-GV, Metaphase I-MI and Metaphase II-MII).The mitochondrial distribution was classified as peripheral/semiperipheral and diffuse in clusters/granules, evaluated after stained with the MitoTracker® Orange CMTMRos, and was also identified the intensity of it. To determine the intensity of ROS oocytes were stained with DCF. The statistical analysis was performed by SAS GLIMMIX PROC. In Experiment 1 oocytes matured only with the FSH reached a smaller nuclear maturation when compared to those who were matured with Kisspeptin at different concentrations (FSH:13/33; FSH + 10-7M Kp-10: 28/35; FSH + 10-6M Kp-10:30/34; FSH + 10-5M Kp-10:28/32; P=0,0001). There was no statistical difference in mitochondrial distribution between treatments (P>0.05). The fluorescence intensity of MitoTracker did not differ among treatments (P>0.05). The DCF fluorescence intensity was lower when the concentration of Kp was increased in the medium (FSH:12177726,1; FSH + 10-7M Kp-10:10945982,83; FSH + 10-6M Kp-10:9820536,53; FSH + 10-5M Kp-10:9147016,38; P<0,0001). Based in the Experiment 1 results, the concentration of Kp was determined in 10-7M. In Experiment 2 the mitochondrial distribution was different between treatments, because oocytes matured only with Kp or FSH+LH, reached a oocyte competence greater than those maturated with FSH only or without hormone addition (no hormones:66,66%; FSH:66,66%; FSH + Kp-10:75,86%; FSH + LH:91,17%; FSH, LH + Kp-10:82,85%; Kp-10:91,17%; P<0,05). The no hormones resulted in a lower nuclear maturation than the other treatments (no hormones: 5/18; FSH:18/32; FSH + Kp-10:22/29; FSH + LH:26/33; FSH, LH + Kp-10:26/34; Kp-10:25/34; P=0,0094). The fluorescence intensity of probes MitoTracker and DCF was lower when Kp was added to the maturation medium (no hormones:1228363/540069; FSH:2307984/1395751; FSH + Kp-10:1941890/1114948; FSH + LH:2502145/1722376; FSH, LH + Kp-10:2286173/1467782; Kp-10:1859411/979325 P<0,0001). So this is the first study that shows that Kisspeptin stimulates oocyte maturation without the presence of gonadotropins in the maturation medium.

Dissertação (Mestrado)

Objetivou-se avaliar diferentes concentrações de kisspeptina, assim como a interação da kisspeptina e FSH/LH na MIV e competência ovocitária de bovinos. No experimento 1 foi determinada a concentração mínima de Kisspeptina (Kp) a ser utilizada, e no Experimento 2 foi avaliada sua interação com FSH e LH. Foram coletados ovários bovinos em abatedouro comercial e apenas ovócitos Grau I foram utilizados. Os ovócitos foram cultivados em meio TCM-199 com Bicarbonato, acrescido de 10% de SFB, piruvato de sódio (22μg/mL), amicacina (83mg/mL), FSH (0,5 μg/mL) com diferentes concentrações de Kp, sendo: FSH + 0M Kp-10; FSH + 10-7M Kp-10, FSH + 10-6M Kp-10; FSH + 10-5M Kp-10. No Experimento 2, foi utilizada a melhor concentração de Kp encontrada no Experimento 1, nos seguintes tratamentos: sem hormônios; FSH; FSH + Kp-10; FSH + LH; FSH, LH + Kp-10; Kp-10. A competência ovocitária foi determinada pela maturação nuclear, distribuição mitocondrial, intensidade de fluorescência de MitoTracker® Orange CMTMRos e DCF. A avaliação da maturação nuclear foi realizada após as 24hs de incubação e os ovócitos foram corados com DAPI para determinar o estágio nuclear (Vesícula Germinativa-VG, MetáfaseI-MI e MetáfaseII-MII). A distribuição mitocondrial foi classificada em periférica/semiperiférica e difusa em aglomerados/grânulos, foi avaliada após a coloração com o MitoTracker® Orange CMTMRos e também foi identificado a intensidade da mesma. Para determinar a intensidade de ROS os ovócitos foram corados com DCF. As análises foram realizadas pelo PROC GLIMMIX do SAS. No Experimento 1 ovócitos em meio com apenas FSH atingiram uma menor maturação nuclear quando comparados àqueles maturados com a Kp em diferentes concentrações (FSH:13/33; FSH + 10-7M Kp-10: 28/35; FSH + 10-6M Kp-10:30/34; FSH + 10-5M Kp-10:28/32; P=0,0001). Não houve diferença estatística na distribuição mitocondrial entre os tratamentos (P>0,05). A intensidade de fluorescência do MitoTracker não variou entre os tratamentos (P>0,05). A intensidade de fluorescência do DCF foi menor, quanto maior a concentração de Kp no meio (FSH:12177726,1; FSH + 10-7M Kp-10:10945982,83; FSH + 10-6M Kp-10:9820536,53; FSH + 10-5M Kp-10:9147016,38; P<0,0001). Baseado nos resultados do Experimento 1, a concentração de Kp foi determinada em 10-7M. No Experimento 2 a distribuição mitocondrial foi diferente entre os tratamentos, pois ovócitos maturados apenas com Kp ou FSH+LH, atingiram uma maior competência ovocitária do que aqueles que foram maturados apenas com FSH ou sem a adição dos hormônios (sem hormônio:66,66%; FSH:66,66%; FSH + Kp-10:75,86%; FSH + LH:91,17%; FSH, LH + Kp-10:82,85%; Kp-10:91,17%; P<0,05). O sem hormônio resultou em uma menor maturação nuclear do que os demais tratamentos (sem hormônio: 5/18; FSH:18/32; FSH + Kp-10:22/29; FSH + LH:26/33; FSH, LH + Kp-10:26/34; Kp-10:25/34; P=0,0094). A intensidade de fluorescência das probes MitoTracker e DCF foi menor quando a Kp foi adicionada ao meio de maturação (sem hormônio:1228363/540069; FSH:2307984/1395751; FSH + Kp-10:1941890/1114948; FSH + LH:2502145/1722376; FSH, LH + Kp-10:2286173/1467782; Kp-10:1859411/979325 P<0,0001). Assim, esse é o primeiro trabalho que evidencia que a Kisspeptina estimula a maturação ovocitária sem a presença de gonadotrofinas no meio de maturação.