Variabilidade genética de Leishmania spp. circulantes entre seres humanos e cães e infecção de flebotomíneos em áreas endêmicas para as leishmanioses no Rio Grande do Norte

Leishmania infantum is the main etiologic agent of visceral leishmaniasis in the New World. The pattern of distribution of leishmaniasis has changed substantially and has presented an emerging profile within the periphery of the Large Urban Centers. Leishmania infection can compromise skin, mucosa and viscera. Only 10% of the individuals infected develop the disease and 90% of human infection is asymptomatic. The main factors involved in the development of the disease are the host immune response, the vector’s species and the parasite’s genetic content. The sequencing of Leishmania isolated seeks to increase the understanding of the symptoms of individuals. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of circulating Leishmania strains among humans, and symptomatic and asymptomatic, and dogs from endemic areas of Rio Grande do Norte State and analyze sandflies from endemic areas for cutaneous and visceral disease. The genetic variability was evaluated by the use of markers hsp70 , ITS1 and a whole genome sequencing was also carried out. The amplified hsp70 and ITS1 of samples were analyzed and assembled using a Phred / Phrap package. The dendograms were constructed using the same methodology, but adding 500 bootstraps, followed by inferences on the relationships between Leishmania variants. The sequences of the 20 Brazilian isolates were mapped to the reference genome L. infantum JPCM5, using the Bowtie2 program and the identification of 36 contigs. The information of the valid SNPs were used in the PCA. SNPs were visualized by Geneious 7.1 and IGV. The genome annotations were transferred to their respective chromosomes and displayed on Geneious. The matching sequences of all chromosomes were aligned using Mauve. The phylogenetic trees were calculated according to maximum likelihood and JTT models. Sandflies were analyzed by PCR for the identification of Leishmania infection, a blood meal source and GAPDH sand fly. As a result, hsp70 and ITS1 were not capable of identifying genetic variability among human isolates from symptomatic and asymptomatic, and dogs. The complete sequencing of the 20 Brazilian isolates revealed a strong similarity between the circulating Leishmania strains in Rio Grande do Norte. The isolates collected in the city of Natal from humans and canines remained grouped in all analyzes, suggesting that there is genotypic and geographic proximity among the isolates. The isolated samples in the 1990s had a higher genotypic diversity when compared to freshly isolated samples. All isolates presented 36 chromosomes with variable ploidy among them, no correlation was found between the number of amastina genes copies, gp63, A2 and SSG with such clinic forms. In general, we did not find correlation between symptomatic and asymptomatic clinical forms and the gene content of the Brazilian isolates of Leishmania. 34,28% of the sandflies collected in the upper west region were L. longipalpis and the main sources of blood meal were humans, dogs and chickens.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Nas Américas, a infecção por Leishmania tem como principal agente etiológico Leishmania infantum. Nos últimos 30 anos o padrão de distribuição das leishmanioses tem mudado substancialmente e a doença tem apresentado um perfil emergente na periferia dos grandes centros urbanos. A infecção por Leishmania pode evoluir com um amplo espectro clínico desde o acometimento da pele, mucosas e vísceras. Dos indivíduos infectados por L. infantum apenas 10% desenvolvem a doença, sabe-se que 90% da infecção humana é assintomática e diversos fatores estão envolvidos no curso da infecção. Os principais fatores envolvidos no desenvolvimento da doença são a resposta imune do hospedeiro, a espécie e o conteúdo gênico do parasita. O sequenciamento dos isolados de Leishmania poderia aumentar a compreensão acerca da sintomatologia dos indivíduos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a diversidade genética de cepas de Leishmania circulantes entre humanos, sintomáticos e assintomáticos e cães de áreas endêmicas do Rio Grande do Norte. A variabilidade genética de um grupo de amostras de humanos e caninos com a doença visceral, doença cutânea e infecção assintomática foi avaliado com os marcadores moleculares hsp70 e ITS1. O genoma completo de 20 isolados de Leishmania oriundos de humanos, sintomáticos e assintomáticos, e cães foram sequenciados para avaliar a diversidade dessas amostras. Os fragmentos amplificados de hsp70 e ITS1 das amostras e foram analisados e montadas utilizando o pacote Phred/Phrap. Os dendogramas foram construídos aplicando o método neighbor joining com 500 bootstraps, seguido das inferências sobre as relações entre as variantes de Leishmania. As sequências dos 20 isolados brasileiros foram mapeadas com o genoma de referência Leishmania infantum JPCM5, usando o programa Bowtie2, com identificação de 36 contigs. As informações dos SNPs válidos foram utilizadas na PCA. Os SNPs foram visualizados pelo Geneious 7.1 e IGV. As anotações do genoma foram então transferidas para seus respectivos cromossomos e visualizadas utilizando o Geneious. As sequências consenso de todos os cromossomos (com mínimo de 75% das reads com a mesma base) foram alinhadas usando Mauve. As árvores filogenéticas foram calculadas de acordo com cálculos de máxima verossimilhança e modelos JTT. Como resultados obtivemos que hsp70 e ITS1 não foram capazes de definir variabilidade genética entre os isolados de humanos e cães; nem para os isolados de cultura e de sangue periférico, oriundos de um mesmo paciente.O sequenciamento genômico dos 20 isolados brasileiros revelou uma forte relação entre as cepas de Leishmania circulantes em no Rio Grande do Norte. Os isolados da Grande Natal de humanos e caninos permaneceram agrupados em todas as análises, sugerindo que existe proximidade genotípica e geográfica entre os isolados. As amostras isoladas na década de 1990 apresentaram uma maior diversidade genotípica quando comparadas as amostras recentemente isoladas. De forma geral, não encontramos correlação entre as formas clínicas sintomáticas e assintomáticas e o conteúdo gênico dos isolados brasileiros de Leishmania.