Modelagem dos efeitos da irradiação luminosa no cérebro de camundongos e rastreamento de neurônios durante experimentos de microscopia de fluorescência

The fluorescent proteins are an essential tool in many fields of biology, since they allow us to watch the development of structures and dynamic processes of cells in living tissue, with the aid of fluorescence microscopy. Optogenectics is another technique that is currently widely used in Neuroscience. In general, this technique allows to activate/deactivate neurons with the radiation of certain wavelengths on the cells that have ion channels sensitive to light, at the same time that can be used with fluorescent proteins. This dissertation has two main objectives. Initially, we study the interaction of light radiation and mice brain tissue to be applied in optogenetic experiments. In this step, we model absorption and scattering effects using mice brain tissue characteristics and Kubelka-Munk theory, for specific wavelengths, as a function of light penetration depth (distance) within the tissue. Furthermore, we model temperature variations using the finite element method to solve Pennes’ bioheat equation, with the aid of COMSOL Multiphysics Modeling Software 4.4, where we simulate protocols of light stimulation tipically used in optogenetics. Subsequently, we develop some computational algorithms to reduce the exposure of neuron cells to the light radiation necessary for the visualization of their emitted fluorescence. At this stage, we describe the image processing techniques developed to be used in fluorescence microscopy to reduce the exposure of the brain samples to continuous light, which is responsible for fluorochrome excitation. The developed techniques are able to track, in real time, a region of interest (ROI) and replace the fluorescence emitted by the cells by a virtual mask, as a result of the overlay of the tracked ROI and the fluorescence information previously stored, preserving cell location, independently of the time exposure to fluorescent light. In summary, this dissertation intends to investigate and describe the effects of light radiation in brain tissue, within the context of Optogenetics, in addition to providing a computational tool to be used in fluorescence microscopy experiments to reduce image bleaching and photodamage due to the intense exposure of fluorescent cells to light radiation.

As proteínas fluorescentes constituem uma ferramenta fundamental em vários campos da biologia, pois permitem enxergar o desenvolvimento de estruturas e processos dinâmicos de células em tecido vivo, com o auxílio da microscopia de fluorescência. A Optogenética é outra técnica que atualmente ganha destaque na Neurociências e que, de forma geral, permite ativar/desativar neurônios a partir da irradiação luminosa de certos comprimentos de onda sobre as células que possuem canais iônicos sensíveis à luz, e ainda pode ser utilizada concomitantemente com as proteínas fluorescentes. Esta tese possui dois objetivos principais. Inicialmente, são estudados os efeitos da interação da luz e o cérebro de camundongos para aplicações em experimentos de Optogenética. Nesta etapa, são modelados, a partir de características do cérebro de camundongos e utilizando a teoria de Kulbelka-Munk, os efeitos de absorção e espalhamento da luz, em comprimentos de onda específicos, em função da distância de penetração no tecido cerebral. Além disso, são modeladas as variações de temperatura utilizando o método dos elementos finitos na resolução da equação de bioaquecimento de Pennes, com o auxílio do COMSOL Multiphysics Modeling Software 4.4, onde são simulados protocolos de estimulação luminosa, tipicamente utilizados em Optogenética. Posteriormente, são desenvolvidos algoritmos computacionais capazes de reduzir a exposição das células nervosas à irradiação luminosa necessária à visualização da fluorescência emitida por elas. Nesta etapa, são descritas as técnicas de processamento digital de imagens desenvolvidas para uso em microscopia de fluorescência, com o intuito de reduzir a exposição das amostras de cérebro à luz contínua, responsável pela excitação dos fluorocromos. As técnicas de processamento de imagens desenvolvidas e utilizadas são capazes de rastrear, em tempo real, uma região de interesse (ROI) e substituir a fluorescência emitida pelas células por uma máscara virtual, como resultado da sobreposição da ROI que está sendo rastreada e a informação de fluorescência previamente armazenada, mantendo a localização das células independentemente do tempo de exposição à luz fluorescente. Em resumo, esta tese pretende entender os efeitos da irradiação luminosa no cérebro, no contexto da Optogenética, além de fornecer uma ferramenta computacional que possa auxiliar certos experimentos em microscopia de fluorescência na redução do desvanecimento (bleaching) das amostras e dos danos (photodamage) causados ao tecido devido à intensa exposição das estruturas fluorescentes à luz.