Perfil imunológico associado à susceptibilidade, resistência e cura na infecção por Leishmania ( Leishmania ) infantum

Visceral Leishmaniasis (VL) is endemic in Brazil and the northeast region had the highest incidence of the disease , despite, in the last 30 years, it has spread to all geographic regions of the country. Leishmania infantum is the m ain etiological agent of VL in Latin America, Europe and North Africa. However, not all infected individuals develop the disease; in fact, the majority present spontaneous re solution of infection without symptoms. The evaluation of the immunological profil e has been mostly conducted stimulating, with Leishmania spp. antigen, peripheral blood mononuclear cells isolated from subjects with VL. These studies showed that VL patients had an inhibition of both, lymphocyte proliferation and proinflammatory response to Leishmania spp. antigen. Our study aimed to evaluate the immune response in active LV, cured post treatment and asymptomatic infection. To reach this aim, we analyzed immunophenotypic features related to activation, Treg and memory lymphocytes, by flow cytometry, as well as, evaluation of cytokine production, in ex vivo or in whole blood culture. In active VL volunteers, a longitu dinal study was conducted with reassessment at 4 and 14 months after clinical cure. The control group included individuals th at live d in endemic region and were either Positive Control, consisting of individuals with positive anti - L eishmania spp. serology and/or positive PCR for Leishmania  spp. and Negative Control composed by individuals with negative anti - Leishmania antibodie s serology and negative PCR for Leishmania . During VL, CD4 lymphocytes showed greater activation and memory profile s and were the major source of cytokines in culture when compared to CD8 lymphocytes , and these were not Leishmania specific. There were act ivated lymphocytes during VL (CD4 + CD69 + :4.9%) when compared to control groups, Positive (CD4 + CD69 + :1.96%, p=0.0045) and Negative (CD4 + CD69 + :1.35%, p=0.006), on the other hand, this was non - specific activation. The lymphocyte activation profile remain ed el evated even 14 months post treatmen t. A fter clinical cure , the activation was Leishmania specific (CD4 + CD25 + absence of SLA: 8.4%, and presence of SLA: 10.7% p=0.0279). CD8 + CD25 + lymphocytes were able to produce Leishmania specific IFN - γ in both, Positive Controls (absence of SLA 5.2% and presence of SLA: 9.5%, p=0.0391) and Cured 4 month (absence of SLA: 3.9%; presence of SLA: 10.7% p=0.0098). Whole blood culture cells, of VL patients, were able to produce IFN - γ, by SLA stimulation (absence of SLA: 28.0 pg ∕mL, and presence: 44.3 pg∕mL p=0.0020) as well as recovered groups (absence of SLA 2.3 pg∕mL and presence of SLA 139.8 pg∕mL, p=0.0005). However, the high level of IL - 10 seem ed to inhibit pro - inflammatory activity of IFN - γ and TNF - α during symptomatic dis ease . Unlike other pro - inflammatory cytokines, active VL group d id not produce Leishmania specific IL - 2 (absence of SLA 2.4 pg∕mL and presence of SLA: 2.6 pg∕mL). Based on these data we conclude that the restoration of lymphocyte activation and decreased i n IL - 10 Leishmania specific production were related to a protective immune profile.

A leishmaniose visceral (LV) é endêmica no Brasil, sendo a região nordeste a que apresenta maior incidência, apesar de nos últimos 30 anos ter aumentado o número de casos em outras regiões do país. A LV na América Latina é resultante da infecção por Leishmania infantum. No entanto, nem todas as pessoas infectadas desenvolvem doença; na verdade, a maioria apresenta resolução espontânea da infecção sem sintomas característicos de LV. Tradicionalmente a avaliação do perfil imunológico tem sido realizada utilizando a reestimulação de células mononucleares de sangue periférico em cultura. Esses estudos revelaram que pacientes com LV apresentavam inibição tanto da proliferação linfocitária quanto da resposta pró-inflamatória anti-Leishmania. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta imune na LV sintomática, na cura pós-tratamento e assintomática. Para isso, analisamos características imunofenotípicas relacionadas à ativação, Treg e memória de linfócitos, por citometria de fluxo, assim como a produção de citocinas ex vivo ou em cultura de sangue total. Para os voluntários com LV, foi realizado um estudo longitudinal com reavaliação imunológicas aos 4 e 14 meses após a cura clínica. O grupo controle incluiu pessoas provenientes de região endêmica, sendo dividido em 2 grupos: Controle Positivo, formado por pessoas que apresentaram sorologia e∕ou PCR anti-Leishmania positivos e Controle Negativo formado por pessoas com sorologia e PCR anti-Leishmania negativos. Durante a LV os linfócitos CD4 apresentam um maior perfil de ativação e memória, além de serem maiores produtores de citocinas em cultura, quando comparado aos linfócitos CD8, contudo essa ativação não é Leishmania específica, visto que ocorreu tanto em ausência (CD4+CD25+:10,60%, CD8+CD25+:5,36%; p<0,0001) quanto em presença de antígenos solúveis de Leishmania (SLA), (CD4+CD25+: 10,20%, CD8+CD25+:3,28%; p=0,0003). Há ativação de linfócitos durante a LV (CD4+CD69+: 4,9%), quando comparado aos grupos Controle Positivo (CD4+CD69+: 1,96% p=0,0045) e Negativo (CD4+CD69+: 1,35% p=0,0062), mas esta ativação também não é Leishmania específica. O perfil de ativação linfocitária permanece elevado mesmo 14 meses após o fim do tratamento, porém após a cura a ativação é Leishmania específica (CD4+CD25+ em ausência de SLA: 8,44%, presença de SLA: 10,70% p=0,0279). Linfócitos CD8+CD25+ foram capazes de produzir IFN-γ em presença de antígeno tanto em Controles Positivos (ausência de SLA: 5,17%, presença de SLA: 9,52% p=0,0391) como em LV curados (Curado 4 meses: ausência de SLA: 3,90%, presença SLA: 10,70% p=0,0098). Células presentes no sangue total de pessoas com LV ativa são capazes de produzir IFN-γ em resposta ao SLA (IFN-γ em ausência de SLA: 3,61 pg∕mL e em presença de SLA: 44,26 pg∕mL; p=0,0020), assim como LV recuperado (IFN-γ em ausência de SLA: 2,29 pg∕mL e presença de SLA: 139,80 pg∕mL; p=0,0005). Contudo o elevado nível de IL-10 parece estar inibindo a atividade pro-inflamatória de IFN-γ e TNF-α em pacientes na fase sintomática. Contrariamente as demais citocinas pro-inflamatórias, a cultura de sangue total do grupo LV ativa não apresentou produção de IL-2 Leishmania específica (em ausência de SLA: 2,42 pg∕mL e em presença de SLA: 2,56 pg∕mL). Com base nesses dados nós concluímos que a restauração da ativação de linfócitos e a diminuição da produção de IL-10, Leishmania específica, estão relacionados à um perfil imunológico protetor.