S. cerevisiae as a model for studying mutations in the human gene OPA1 associated with dominant optic atrophy and for drug discovery

L’atrofia ottica dominante (ADOA) è una malattia mitocondriale caratterizzata da difetti visivi, che si manifestano durante l’infanzia, causati da progressiva degenerazione delle cellule gangliari della retina (RGC). ADOA è una malattia genetica associata, nella maggior parte dei casi, a mutazioni nel gene OPA1 che codifica per la GTPasi mitocondriale OPA1, appartenente alla famiglia delle dinamine, principalmente coinvolta nel processo di fusione mitocondriale e nel mantenimento del mtDNA. Finora sono state identificate più di 300 mutazioni patologiche nel gene OPA1. Circa il 50% di queste sono mutazioni missenso, localizzate nel dominio GTPasico, che si pensa agiscano come dominanti negative. Questa classe di mutazioni è associata ad una sindrome più grave nota come “ADOA-plus”. Nel lievito Saccharomyces cerevisiae MGM1 è l’ortologo del gene OPA1: nonostante i due geni abbiano domini funzionali identici le sequenze amminoacidiche sono scarsamente conservate. Questo costituisce una limitazione all’uso del lievito per lo studio e la validazione di mutazioni patologiche nel gene OPA1, infatti solo poche sostituzioni possono essere introdotte e studiate nelle corrispettive posizioni del gene di lievito. Per superare questo ostacolo è stato pertanto costruito un nuovo modello di S. cerevisiae, contenente il gene chimerico MGM1/OPA1, in grado di complementare i difetti OXPHOS del mutante mgm1Δ. Questo gene di fusione contiene una larga parte di sequenza corrispondente al gene OPA1, nella quale è stato inserito un set di nuove mutazioni trovate in pazienti affetti da ADOA e ADOA-plus. La patogenicità di queste mutazioni è stata validata sia caratterizzando i difetti fenotipici associati agli alleli mutati, sia la loro dominanza/recessività nel modello di lievito. A tutt’oggi non è stato identificato alcun trattamento farmacologico per la cura di ADOA e ADOA-plus. Per questa ragione abbiamo utilizzato il nostro modello di lievito per la ricerca di molecole che agiscono come soppressori chimici, ossia composti in grado di ripristinare i difetti fenotipici indotti da mutazioni nel gene OPA1. Attraverso uno screening fenotipico high throughput sono state testate due differenti librerie di composti chimici. Questo approccio, noto con il nome di drug discovery, ha permesso l’identificazione di 23 potenziali molecole attive.

Autosomal Dominant optic atrophy (ADOA) is a mitochondrial disease characterized by an insidious onset of visual impairment in early childhood due to selective degeneration of retinal ganglion cells. ADOA is a genetically inherited disorder associated, in most cases, with mutations in the OPA1 gene encoding the mitochondrial GTPase of the dynamin family OPA1, primarily involved in mitochondrial fusion and in mtDNA maintenance. More than 300 pathogenic mutations spread throughout the entire OPA1 gene have been identified so far. About 50% of these are missense mutations, mostly clustered in the GTPase domain, envisaged to exert a severe dominant negative effect. These latter mutations are often associated with a more severe syndromic disorder named “ADOA-plus”. In the yeast Saccharomyces cerevisiae MGM1 is the orthologous of OPA1 gene. Mgm1 and OPA1 own equivalent functional domains; however, their amino acid sequences are poorly conserved. This constitutes a limitation to the use of yeast for the study and validation of OPA1 pathological mutations, since only few pathological substitutions found in patients can be introduced in the corresponding positions of the yeast gene. To overcome this obstacle a novel S. cerevisiae model has been constructed, by generating a MGM1/OPA1 chimeric gene able to complement the OXPHOS defect of the mgm1Δ mutant. This fusion gene contains a large part of OPA1 in which a set of new DOA and DOA plus associated mutations have been introduced. The pathogenicity of these mutations has been validated, both by characterizing the phenotypic defects associated with the mutant alleles, and investigating their dominance/recessivity in the yeast model. Since no therapeutic treatment is currently available for ADOA and ADOA-plus, we exploited our S. cerevisiae model for the search of molecules acting as chemical suppressors, able to rescue the mitochondrial defective phenotypes induced by pathogenic mutations in the OPA1 gene. A yeast-based phenotype high throughput screening has been set up and two different chemical libraries have been tested. This drug discovery approach led to the identification of 23 potential active molecules.