Farmacogenética em toxicologia forense : estudo do gene CYP2D6 em amostras post mortem com tramadol

Tese de mestrado, Medicina Legal e Ciências Forenses, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016

A variabilidade genética tem impacto na resposta individual aos fármacos, com repercussões nas concentrações e nos efeitos observados. Os exames de toxicologia forense são importantes para conhecer a contribuição dos xenobióticos na causa de morte e as circunstâncias em que esta ocorreu. A aplicação das metodologias de farmacogenética a casos post mortem é ainda pouco frequente, dependendo sobretudo das características do gene a estudar e da existência de metodologias adequadas à análise de amostras da rotina pericial. Por outro lado, para que os resultados possam ser utilizados como prova em tribunal, é essencial dispor de fundamentação científica para a sua interpretação, que pode ser obtida através de estudos de correlação entre os resultados da genética e da toxicologia. O tramadol é bioactivado por metabolização em O-desmetiltramadol, por acção da enzima CYP2D6. Algumas variantes genéticas são responsáveis por alterações na expressão enzimática e, portanto, na resposta analgésica e nas concentrações encontradas nas amostras post mortem, para o tramadol e para os seus metabolitos. Nos casos post mortem com tramadol, a identificação dos metabolizadores lentos pela pesquisa de variantes genéticas descritas como não-funcionais pode ser útil para explicar algumas circunstâncias relacionadas com a morte. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia de sequenciação parcial do gene CYP2D6 para a detecção de variantes genéticas responsáveis pela inativação da atividade enzimática, tendo em vista a identificação de metabolizadores lentos. A metodologia foi aplicada a casos post mortem positivos para tramadol. Foram selecionadas e analisadas 100 amostras de sangue post mortem com tramadol. O ADN foi extraído pelo método de Chelex 100® e quantificado por Real-time PCR usando Quantifiler Trio da Applied Biosystems (AB). A amplificação dos fragmentos de interesse do gene CYP2D6 foi efetuada por PCR com MasterMix da Qiagen. Os fragmentos amplificados foram sequenciados com Big Dye v.3.1 cycle sequence e detetados por eletroforese capilar num Genetic Analyser 3130 (AB). As sequências obtidas foram comparadas com a de referência usando o programa informático SeqScape v3. O método foi validado de acordo com recomendações internacionais. Foi também validado o método de confirmação quantitativa de tramadol e dos seus metabolitos N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol. Os métodos foram aplicados com sucesso às amostras de sangue post mortem. As distribuições de alelos e de genótipos das amostras analisadas estão de acordo com o esperado para a população portuguesa e europeia. O metabolismo do tramadol, expresso pela razão de concentrações entre os seus metabolitos (N-desmetiltramadol/ O-desmetil-tramadol), demonstrou estar correlacionado com os fenótipos previstos na análise genética, em particular no caso dos metabolizadores lentos. Foi demonstrada também a importância da pesquisa de substâncias inibidoras da actividade enzimática, nos casos de tramadol. De acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo em que a metodologia de sequenciação do gene CYP2D6 foi validada e aplicada com sucesso a amostras post mortem, em Portugal. As metodologias desenvolvidas permitem a recolha sistemática de resultados em casos post mortem, constituindo ferramentas essenciais para fundamentar a utilidade da farmacogenética na interpretação de casos de tramadol, numa avaliação conjunta entre a patologia, a toxicologia e a genética forenses.

Genetic variation is related to individual drug response, with influence in the concentration and effects observed. Forensic toxicology is important to know the contribution of drugs to the cause of death and its circumstances. Forensic pharmacogenetics is a relatively new and growing area of research and to be used in the court decisions it is essential to have reliable methodologies that can be applied to routine analysis. On the other hand, the interpretation of the results depends on the knowledge based on scientific research with statistical coverage that can be obtained by correlation studies between genetic and toxicology results. Tramadol is bioactivated by metabolization to O-demethyl-tramadol, by CYP2D6 enzyme. Some genetic polymorphisms are responsible for the variability in the expression of this enzyme, changing the individual drug response and also the postmortem concentrations of tramadol and its metabolites. The poor-metabolizers identification by detection of allelic variants described as non-functional can be useful to explain some circumstances of death in the study of post-mortem cases with tramadol. The aim of this work was the development of a Sanger sequencing methodology for CYP2D6 gene to identify genetic variants that cause absence of enzyme activity and its application to post-mortem cases with tramadol. 100 post-mortem blood samples were selected and analyzed. DNA was extracted by Chelex 100® method and quantitated with Applied Biosystems (AB) Quantifiler Trio Kit ® by Real-time PCR. Genetic fragments amplification was done by PCR using Qiagen MasterMix. Sanger sequencing was performed with Big Dye v.3.1 cycle sequence and detected in a Genetic Analyser 3130 (AB). Allelic variants were found comparing the results with a reference sequence using SeqScape v3 software. The sequencing method was validated following international guidelines as well as the method used for tramadol and main metabolites quantification. The methods were successfully applied to post mortem blood samples. Alleles and genotype frequencies were in accordance with the expected for European population. Tramadol metabolism, expressed as its metabolites concentration ratio (Ndesmethyltramadol/ O-desmethyltramadol), has been shown to be correlated with the predicted phenotypes based on genetic characterization. It was also demonstrated the importance of enzyme inhibitors identification in the toxicology analysis. According to our knowledge, this is the first time that a CYP2D6 sequencing methodology is validated and applied to post-mortem samples, in Portugal. The developed methodology allows the data collection of post-mortem cases, which is of primordial importance to enhance the use of these pharmacogenetic tools to explain some circumstances of death in the study of tramadol positive cases and demonstrate the importance of this pharmacogenetics tools to forensic toxicology and pathology.