Dissecting the signaling mechanisms of IL-7-mediated autophagy regulation in T-cell acute lymphoblastic leukemia

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Projeto financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian e pelo 16º Programa GAPIC

T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) constitutes an aggressive subset of ALL, the most frequent childhood malignancy. Despite successful chemotherapy, we still need more effective, specific and less toxic therapeutics. Interleukin-7 (IL-7) is essential for normal T-cell development and there is considerable evidence that IL-7-mediated signaling can promote leukemogenesis. Previously, we showed that IL-7 promotes T-ALL proliferation, survival and metabolic activation dependent on PI3K/Akt/mTOR pathway activity. Autophagy is upregulated in rapidly dividing cells, such as cancer cells. However, when persistent, its protective role may shift to what is called autophagic cell death. mTOR is recognized as the master negative regulator of this process. Since IL-7 regulates mTOR activation we decided to explore whether IL-7 may also regulate T-ALL cell autophagy and elucidate its molecular mechanisms. Understanding this modulation may lead to the identification of new molecular targets with therapeutic value. Methods: We used a human IL-7 dependent T-ALL cell line, TAIL7, and signaling pathways inhibitors: LY2940002 (PI3K inhibitor), rapamycin (mTOR inhibitor), U0126 (MEK1/2 inhibitor) and a small-molecule inhibitor of STAT5. We evaluated the autophagic rate using the lysosomal inhibitor hydroxychloroquine (HCQ) and assessed LC3 cleavage and puncta formation. We collected data by western blot, confocal microscopy and flow cytometry. Conclusion: Our data suggest that overall IL-7 inhibits autophagy in T-ALL, albeit in a complex manner that involves triggering both pro- (via MEK/Erk) and (via PI3K/Akt/mTOR) anti-autophagic signaling pathways. Notably, MEK/Erk pathway activation appears to be absolutely required for autophagy in T-ALL cells, hinting a role on autophagy regulation that extends beyond the IL-7 context. As autophagy is often associated with chemoresistance but also with cell death, a deeper comprehension of its regulation mechanisms may contribute to finding new therapeutic targets in T-ALL.

A leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) constitui um subtipo agressivo de LLA, o tumor maligno mais frequente em pediatria, pelo que apesar das actuais terapêuticas de sucesso continuamos a necessitar de terapêuticas mais específicas, eficazes e menos tóxicas. A interleucina-7 (IL-7), além de muito importante para o desenvolvimento das células T normais, pode promover, em determinadas circunstancias, o desenvolvimento da leucemia. Anteriormente, mostrámos que a IL-7 promove a proliferação, sobrevivência e ativação metabólica de LLA-T, dependente da atividade da via PI3K/AKT/mTOR . A autofagia, é rapidamente ativada durante a privação de nutrientes associada a divisão celular rápida, como em células tumorais. No entanto, quando persistente, o seu papel de proteção pode mudar para o que é chamado de morte celular autofágica. mTOR é reconhecido como o principal regulador negativo deste processo. Uma vez que a IL-7 regula a ativação de mTOR, decidimos explorar se a IL-7 também pode regular a autofagia em LLA-T e elucidar os seus mecanismos moleculares, com o objetivo futuro de identificação de novos alvos terapêuticos moleculares. Métodos: Utilizámos uma linha celular LLA-T humana dependente de IL-7, TAIL7, e inibidores de vias de sinalização: LY2940002 (inibidor de PI3K), rapamicina (inibidor de mTOR), U0126 (inibidor de MEK1/2) e um inibidor de STAT5. Foram avaliadas as taxas autofágicas usando a hidroxicloroquina (HCQ), um inibidor lisossómico, e analisadas a clivagem de LC3 e a formação de LC3 puncta. Os dados foram obtidos por western blot (WB), microscopia confocal (MC) e citometria de fluxo (CF). Conclusões: Os nossos dados sugerem que a IL-7 inibe a autofagia em LLA-T, de uma forma complexa que envolve a ativação concomitante de vias pró- (via MEK/Erk) e anti-autofágicas (PI3K/Akt/mTOR). É de realçar que, a via MEK/Erk parece ter um papel fundamental na indução de autofagia em LLA-T, que pode ir para além do contexto IL-7. A autofagia está frequentemente associada quimioresistência mas também a morte celular, pelo que uma compreensão mais profunda dos seus mecanismos de regulação poderá contribuir para encontrar novos alvos terapêuticos em LLA-T.