Einfluss des Calcium-sensitiven Rezeptors auf knochenspezifische Metastasierungsprozesse des Nierenzellkarzinoms

Der Grund für die schlechte Prognose beim Nierenzellkarzinom (NZK) stellt nicht der Primärtumor dar sondern ist vielmehr der häufigen Ausbildung von Fernmetastasen geschuldet. Etwa 30 % aller Patienten mit fortgeschrittenem NZK bilden dabei Metastasen in den Knochen aus. Das Knochenmilieu scheint, aufgrund der hohen Frequenz der knochenspezifischen Metastasierung, einen idealen Wachstumslokus für die Nierenkarzinomzellen dazustellen und rückte in der jüngsten Vergangenheit in den Fokus der Forschung. Dabei konnte der Calcium-sensitive Rezeptor (CaSR), der im gesunden Gewebe die Konzentration der extrazellulären Calcium-Ionen reguliert und besonders in der Niere von Bedeutung ist, mit der Metastasierung in die Knochen in Zusammenhang gebracht werden. Die Knochen stellen im Körper das Organ mit der höchsten Calcium-Konzentration dar. Durch ständigen Knochenmetabolismus werden Calcium-Ionen freigesetzt, welche CaSR-exprimierende Zellen aktivieren können. Aus diesem Grund wurden im Zusammenhang mit dieser Arbeit Nierenkarzinomzellen (786 O) sowie gesunde Nierenzellen (HEK 293) mit dem Gen des CaSR transfiziert und anschließend unter dem Einfluss von Calcium (10 mM – 30 Min.), einem CaSR-Aktivator (Cinacalcet (10 µM – 1 Std.)), sowie einem CaSR-Inhibitor (NPS2143 (10 µM – 1 Std.)) auf Unterschiede im zellulären Verhalten hin untersucht.rnBereits ohne Calcium-Behandlung zeigten die CaSR-transfizierten 786 O-Zellen ein gesteigertes Migrationsverhalten (durchgeführt in einer Boyden Kammer, Fibronektin als Chemotaxin) und ein erhöhtes Adhäsionspotential (zum einen an Kompo¬nenten der EZM (Fibronektin und Kollagen I) und zum anderen an HUVEC). Bei den CaSR-transfizierten HEK 293-Zellen wurde nur die Migration positiv beeinflusst. Nach einer 30-minütigen Behandlung mit Calcium zeigten die CaSR-transfizierten 786 O-Zellen eine starke Zunahme des Adhäsions- und Proli¬ferations-verhaltens, sowie eine verstärkte Migration bei Verwendung von Calcium als Chemotaxin. CaSR-transfizierte HEK 293-Zellen hingegen zeigten keine Migration und nach Calcium-Behandlung nur geringfügige Änderungen in Adhäsion und Proliferation. Konsistent mit diesen Ergebnissen war die Auswertung der intrazellulären Signalwege mit Hilfe von Western Blot-Analysen. In CaSR-expri-mierenden 786 O-Zellen waren die Signalwege AKT, ERK, JNK und p38α nach Calcium-Behandlung deutlich erhöht. In den HEK 293-Zellen kam es zu einer Zunahme der Proteinmenge aktivierter ERK-, JNK-, Paxillin- und SHC-Moleküle. Mit Hilfe einer Kombinationsbehandlung aus NPS2143 und Calcium konnte der Calcium-bedingte Effekt in durchweg allen Untersuchungen wieder bis auf das Kontrollniveau gesenkt werden. Die Verwendung von Cinacalcet und Calcium führte zwar erneut zu deutlichen Steigerungen der zellulären Vorgänge, lag aber immer unter dem Calcium-abhängigen Maximum.rnDurch die Simulation der Vorgänge, die während einer Metastasierung ablaufen, konnte gezeigt werden, dass der CaSR in Nierenkarzinomzellen die Knochen-metastasierung induziert. Sollten sich diese Zusammenhänge in vivo im Mausmodell bestätigen, könnte der CaSR zukünftig als Marker für eine Früherkennung von Knochenmetastasen fungieren. Zudem könnten indivi¬dual¬isierte Therapieansätze entwickelt werden, die knochenmetastasierende Zellen bereits vor Metastasierung effizient bekämpfen können.rn

The poor prognosis of renal cell carcinoma (RCC) is linked to the existence of metastases during primary check-up of the patients. About 30 % of patients with RCC develop bone metastases during disease. The bone milieu seems to play a crucial role in tumor growth due to the high frequency of bone-specific metastasis of RCC. Since increased scientific focus on involved mechanisms, the calcium-sensing receptor (CaSR), a regulator of extracellular calcium-concentration and a key protein in kidney calcium-homeostasis, was associated with bone-specific metastasis.rnThe highest calcium-concentration throughout the body is found in bones. During bone metabolism, calcium ions are released and able to activate CaSR expressing cells. Relating to this work renal carcinoma cells (786 O) and healthy kidney cells (HEK 293) were stably transfected with the gene for CaSR. The differences in functional behavior was tested afterwards under influence of calcium (10 mM – 30 min.) or a combination of a CaSR activator (Cinacalcet (10 µM – 1 hr.)) + calcium or a combination of a CaSR inhibitor (NPS2143 (10 µM – 1 hr.)) + calcium, respectively.rnCaSR transfected renal carcinoma cells showed a higher migratory (measured in a Boyden chamber, fibronectin as chemotaxin) and adhesory potential (carried out on components of the extracellular matrix (ECM) (fibronectin and collagen I) or on endothelial cells) even without calcium-influence. Transfected HEK 293-cells showed an increase in migration (fibronectin) but not in adhesion. A 30 minute incubation with calcium lead to a strong increase in adhesion and proliferation of the CaSR transfected 786 O cells. The migration using calcium as a chemotaxin resulted in a stronger migratory potential compared to control cells. CaSR-transfected HEK 293 cells showed no migratory behavior after calcium treatment and only slight enhancements in adhesion potential. Consistent with these results were the findings concerning the intracellular pathways in western blot analyses. The signal pathways of AKT, ERK, JNK and p38α were strongly elevated in 786 O cells expressing the CaSR after calcium treatment. In HEK 293 cells elevated levels of ERK, JNK, SHC and Paxillin were found. The treatment of NPS2143 + calcium led to an inversion of the calcium-triggered effects in nearly all experiments and cells. Treatment of Cinacalcet with calcium again led to an increase in cellular processes but clearly under the calcium-triggered maximum at nearly all times. rnThe CaSR-transfected 786 O cells seem to be able to develop metastases into bones, as in this work the simulation of the typical steps of metastasis revealed. Further investigations, e.g. infusion of the CaSR expressing renal carcinoma cells in a mouse model, need to be done that may lead to a broader understanding of the CaSR and its ability to serve as a biomarker to predict bone metastasis. It is possible to imagine that future therapies regarding the CaSR as a key player in bone-specific metastasis may lead to a superior outcome in treatment of patients affected with the disease.rn