Das GAF-Domänen-Protein NreA : ein neuartiger Nitratrezeptor aus Staphylococcus carnosus

Staphylococcus carnosus ist ein fakultativ anaerobes Bakterium, das aerobe Atmung, anaerobe Nitratatmung und Gärungsstoffwechsel betreiben kann. Die Expression des Nitratstoffwechsels wird durch das Dreikomponentensystem NreABC reguliert.rnUnter anaeroben Bedingungen besitzt die Sensorhistidinkinase NreB in ihrer PAS-Domäne ein [Fe4S4]2+-Cluster. Das aktive (anaerobe) [Fe4S4]2+-NreB überträgt nach Autophosphorylierung die Phosphorylgruppe auf den Antwortregulator NreC, welcher dann die Expression der Gene der Nitratatmung aktiviert. Nitrat wirkt mit Hilfe des NreA-Proteins auf diese Gene induzierend. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass NreA ein GAF-Domänen-Protein und ein neuartiger Nitratrezeptor ist.rnDie Natur von NreA als GAF-Domänen-Protein bestätigte sich beim Vergleich der Kristallstruktur mit denen anderer GAF-Domänen. GAF-Domänen sind weit verbreitet und binden typischer Weise kleine Moleküle. Als physiologischer Ligand von NreA zeigte sich Nitrat, das innerhalb einer definierten Bindetasche gebunden wird. NreA bindet vermutlich in dimerer Form an dimeres NreB und inhibiert dadurch die Phosphorylierung der Sensorhistidinkinase NreB. Die Interaktion von NreA mit NreB wurde in vivo durch BACTH-Messungen und sowohl in vivo als auch in vitro durch Cross-Linking Experimente gezeigt. Nitrat reduziert den Ergebnissen nach die Interaktion von NreA mit NreB.rnDurch Sequenzvergleiche von NreA mit Homologen wurden konservierte Aminosäuren identifiziert. Über gerichtete Mutagenese wurden 25 NreA-Varianten hergestellt und bezüglich ihres Verhaltens in Abhängigkeit von Nitrat in narG-lip-Reportergenstudien getestet. Anhand ihres Phänotyps wurden sie als Wildtyp, NreA- und NreABC-Mutanten klassifiziert. Die Nitratbindetasche war in sechs Fällen betroffen. Die Phänotypen der Mutationen in der Peripherie lassen sich mit Auswirkungen auf die vermutete Konformationsänderung oder auf die Interaktion mit NreB erklären. Mutationen von konservierten, oberflächenexponierten Resten führten vermehrt zu NreA/ON-Varianten. Es ließen sich Bereiche auf der Proteinoberfläche identifizieren, die für NreA/NreA- oder NreA/NreB-Interaktionen wichtig sein könnten.rnDie Untersuchungen zeigten, dass NreA mit NreB interagiert und dass dadurch ein NreA/NreB-Sensorkomplex für die gemeinsame Erkennung von Nitrat und Sauerstoff gebildet wird.

Staphylococcus carnosus is a facultative anaerobic bacterium. It is able to use oxygen and nitrate for respiration, and performs fermentation in the absence of a terminal electron acceptor. S. carnosus employs the regulation of the three-component system NreABC (nitrate regulation element) for expression of the nitrate respiration.rnUnder anaerobic conditions the sensor histidine kinase NreB contains a [Fe4S4]2+-cluster. The active (anaerobic) [Fe4S4]2+-NreB transfers a phosphoryl group to its cognate response regulator NreC after autophosphorylation. Then, NreC-P induces the transcription of the genes for dissimilatory nitrate reduction. In the presence of nitrate the level of gene expression is stimulated due to NreA. In the present work NreA was identified as GAF domain containing protein and as a new type of nitrate receptor.rnBy comparison of the NreA crystal structure with those of other GAF-domains, the postulated GAF-domain could be confirmed. GAF-domains are wide-spread and typically bind small molecules. Nitrate was identified as the physiological ligand of NreA. It binds inside a well-defined binding pocket. Presumably NreA binds to dimeric NreB as a dimer and inhibits the autophosphorylation of the sensor histidine kinase NreB. The interaction of NreA with NreB was shown in vivo with BACTH-measurements, and in vivo and in vitro with cross-linking experiments. Upon nitrate binding, the interaction of NreA with NreB is reduced.rnConserved amino acid residues were indentified based on sequence alignments of NreA with homologue proteins. 25 variants of NreA were created by site-directed mutagenesis. They were tested towards their response to nitrate in narG-lip-reporter gene studies. The NreA variants were classified according to their respective phenotype as wildtype, NreA-, and NreABC-mutants. 6 variants effected directly the nitrate binding pocket. In the periphery, mutations seem to effect the supposed conformational change or alternatively the interaction with NreB. Most of the mutated residues causing a NreA/ON-phenotype are located on the surface. On the protein surface distinct areas were detected that may be important for NreA/NreA or NreA/NreB-interactions.rnThe present studies reveal that NreA interacts with NreB in a way that a combined NreA/NreB sensor complex is formed which recognizes nitrate and oxygen.