Bindeprotein-abhängige DctS-Sensorkinasen aus Bacillus subtilis und Geobacillus kaustophilus

Das Enterobakterium Escherichia coli sowie das Bodenbakterium Bacillus subtilis können C4-Dicarbonsäuren als aerobe Kohlenstoffquelle zur Energiekonservierung nutzen. Die Regulation des C4-Dicarboxylatstoffwechsels erfolgt in E. coli und B. subtilis durch das Zweikomponentensystem DcuSREc bzw. DctSRBs, bestehend aus einer Sensorkinase und einem Responseregulator. Diese kontrollieren die Expression des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA. Der Sensor DcuSEc benötigt für seine Funktion im aeroben Stoffwechsel den Transporter DctA als Cosensor. Für das DctSRBs-System gibt es Hinweise aus genetischen Untersuchungen, dass DctSBs das Bindeprotein DctBBs und möglicherweise auch DctABs als Cosensoren für seine Funktion benötigt. In dieser Arbeit sollte ein direkter Nachweis geführt werden, ob DctBBs und DctABs gemeinsam oder nur jeweils eine der Komponenten als Cosensoren für DctSBs fungieren. Sowohl für DctBBs als auch für DctABs wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit DctSBs durch zwei in vivo Interaktionsmethoden nachgewiesen. Beide Methoden beruhen auf der Co-Reinigung der Interaktionspartner mittels Affinitätschromatographie und werden je nach Affinitätssäule als mSPINE oder mHPINE (Membrane Strep/His-Protein INteraction Experiment) bezeichnet. Die Interaktion von DctSBs mit DctBBs wurde zusätzlich über ein bakterielles Two-Hybrid System nachgewiesen. Nach Coexpression mit DctSBs interagieren DctABs und DctBBs in mSPINE-Tests gleichzeitig mit der Sensorkinase. DctSBs bildet somit eine sensorische DctS/DctA/DctB-Einheit in B. subtilis und das Bindeprotein DctBBs agiert nur als Cosensor, nicht aber als Transport-Bindeprotein. Eine direkte Interaktion zwischen dem Transporter DctABs und dem Bindeprotein DctBBs besteht nicht. Transportmessungen belegen, dass der DctA-vermittelte Transport von [14C]-Succinat unabhängig ist von DctBBs. Außerdem wurde untersucht, ob Zweikomponentensysteme aus anderen Bakteriengruppen nach einem ähnlichen Schema wie DcuSREc bzw. DctSRBs aufgebaut sind. Das thermophile Bakterium Geobacillus kaustophilus verfügt über ein DctSR-System, welches auf genetischer Ebene mit einem Transporter des DctA-Typs und einem DctB-Bindeprotein geclustert vorliegt. Die Sensorkinase DctSGk wurde in E. coli heterolog exprimiert und gereinigt. Diese zeigt in einer E. coli DcuS-Insertionsmutanten Komplementation der DcuS-Funktion und besitzt dabei Spezifität für die C4-Dicarbonsäuren Malat, Fumarat, L-Tartrat und Succinat sowie für die C6-Tricarbonsäure Citrat. In Liposomen rekonstituiertes DctSGk zeigt Autokinase-Aktivität nach Zugabe von [γ-33P]-ATP. Der KD-Wert für [γ-33P]-ATP der Kinasedomäne von DctSGk liegt bei 43 μM, die Affinität für ATP ist damit etwa 10-fach höher als in DcuSEc.

The bacteria Escherichia coli and Bacillus subtilis use C4-dicarboxylates as aerobic C-sources to conserve energy. The regulation of the C4-dicarboxylate metabolism in E. coli and B. subtilis is achieved by the two-component system DcuSR or DctSR, respectively. The two-component system is comprised of a sensor kinase and a response regulator. They control the expression of the C4-dicarboxylate transporter DctA. In the aerobic metabolism, the sensor kinase DcuS of E. coli uses the transporter DctA as a cosensor. Genetic experiments indicate a role of the binding Protein DctB and the transporter DctA as cosensors for the DctSR system in Bacillus subtilis. In this work, a direct interaction study showed, if both DctB and DctA act as cosensors for DctS in Bacillus subtilis. For both DctB and DctA a direct protein-protein interaction with DctS could be shown in two in vivo interaction assays. Both methods are based on the co-purification of an interaction partner via affinity chromatography and are -according to the affinity tag- described as mSPINE or mHPINE (Membrane Strep/His-Protein INteraction Experiment). The interaction between DctS and DctB was additionally confirmed via a bacterial two-hybrid system. Using the mSPINE assay, DctA and DctB interact with DctS in parallel, so that a sensoric DctS/DctA/DctB unit is formed. Thereby, the binding protein DctB acts as cosensor and not as a binding protein for a transporter. There is no direct interaction between the transporter DctA and the binding protein DctB. Transport measurements show, that the transport of C4-dicarboxylates by DctA is independent from the presence of DctB. Furthermore, it was investigated, if other bacteria contain two-component systems that have a similar composition like DcuSR or DctSR, respectively. The thermophilic bacterium Geobacillus kaustophilus contains a DctSR system, which is genetically clustered with a DctA transporter and a DctB binding protein. The sensor kinase DctS of G. kaustophilus was expressed and purified in E. coli. The protein complements in vivo the function of the DcuS sensor in E. coli and shows specificity for the C4-dicarboxylates malate, fumarate, L-tartrate, succinate and for the C6-tricarboxylic acid citrate. DctS of G. kaustophilus was reconstituted in liposomes and shows autokinase activity. The Kd-value for [γ-33P]-ATP of the kinase domain of DctS is 43 µM and the affinity for ATP is approximately ten times higher as in DcuS from E. coli.