Synthese und Charakterisierung zylindrischer Poly(2-oxazolin)bürsten als Nanocarrier für Drug Delivery Systeme

Inspiriert durch natürlich vorkommende Peptide, sind Poly(2-oxazoline) vielversprechende Kandidaten für Anwendungen in Bereichen des kontrollierten Wirkstoff- bzw. Gentransportes, wie die moderne Biomedizin dies fordert. Da Polyoxazoline als strukturisomere Amide von natürlichen Polypeptiden aufgefasst werden können, zeigen diese synthetischen Polymere in direktem Vergleich erhebliche Vorteile etwa hinsichtlich Zytotoxizät und Effizienz, was wesentlich dazu beitragen kann, aktuelle Hürden biomedizinischer Fragestellungen hinsichtlich Transport und Targeting zu überwinden. Darüber hinaus sollten zylindrische Polymerbürsten aufgrund ihrer molekularen, architekturbedingten Formanisotropie und jüngsten Ergebnissen insbesondere zur formabhängigen Endozytose sehr aussichtsreiche Kandidaten für den Einsatz zum Wirkstofftransport sein.rnrnDie vorliegende Arbeit widmete sich deshalb der Synthese und Charakterisierung von biokompatiblen zylindrischen Poly(2-oxazolin)bürsten als potentielle Nanotransporter von Wirkstoffen, Biomolekülen oder genetischem Material. Als Monomer wurde zunächst 2-Isopropyloxazolin gewählt, da das Polymer eine Phasenübergangstemperatur von 37 °C besitzt, was für Konjugatsynthesen wie auch diverse biomedizinische Applikationen interessant sein kann. Durch terminierende Methacrylamid Funktionalisierung der lebenden kationischen Oxazolinpolymerisation bzw. nachfolgende Endgruppen Transferreaktionen sind Makromonomere im Bereich 1000-5000 g/mol zugänglich. Erstmals gelang es so 2-Oxazolin basierte, hochmolekulare zylindrische Bürsten mit Konturlängen im Bereich von 250 nm mittels „Grafting Through“ Technik in freier radikalischer Polymerisation herzustellen.rnrnAusgehend von der entwickelten Syntheseroute konnten so neben Homo- und Blockcopolymerbürsten von 2-Ethyl-2-oxazolin und 2-Isopropyl-2-oxazolin auch Bürstenmoleküle aus statistischen Copolymeren von 2-Ethyl-2-oxazolin und unsubstituiertem 2-Oxazolin hergestellt werden. Während letztere die Einführung kationischer Gruppen durch selektivere Abspaltmethoden der Formylreste erlauben und so etwa DNA/RNA Komplexierungen ermöglichen können, bietet andererseits der in dieser Arbeit erstmalig demonstrierte Einsatz Azid-funktionalisierter Initiatoren zur kationischen Oxazolinpolymerisation unter Beibehaltung aller anderen sonstigen Reaktionsschritte auch die Möglichkeit der Synthese Azid-Endgruppen-funktionalisierter Makromonomere. Die „Grafting Through“ Methodik der freien radikalischen Makromonomer Polymerisation ist selbst bei diesen funktionalisierten Systemen von großem Vorteil, erlaubt sie auch hier den Zugang zu hochmolekularen Substraten mit einem Pfropfungs- bzw. Funktionalisierungsgrad von 100 %, da jede Seitenkette dieser zylindrischen Bürsten die aussenliegende, und damit sterisch leichter zugängliche funktionale Gruppe trägt. Dabei gelang es die Syntheseroute so zu gestalten, dass es möglich war alle vorgestellten Polymerbürsten mittels statischer und dynamischer Lichtstreuung hinsichtlich absoluter Molmasse und molekularer Dimension zu charakterisieren.rnIn weitereren Reaktionen konnten dann reaktive Fluoreszenzfarbstoffe mit Hilfe kupferfreier 1,3 dipolarerer Addition (kupferfreie „Click-Chemie“) an die Azid-funktionalisierten Polymerbürsten angebunden werden, so dass eine wesentliche Voraussetzung für die Detektion in in vivo und in vitro Experimenten erfüllt werden kann. Darüber hinaus gelingt die quantitative polymeranaloge Umsetzung der Azid- zu Aminogruppen durch eine polymeranalog geführte Reduktion nach Staudinger; damit können an diesen Systemen auch etablierte Konjugationstechniken an Aminogruppen durchgeführt werden. Zudem erlauben die Aminogruppen-haltigen Polymerbürsten durch Protonierung schon bei physiologischem pH die Komplexierung von DNA oder RNA. rnrnErste Lichtstreumessungen in Blutserum zeigen im Falle der kationischen Aminogruppen tragenden Polymerbürsten zwar Aggregation, was aber durch entsprechende Umsetzung nach Konjugation wahrscheinlich unterdrückt werden kann, zeigen doch die entsprechenden Precursorpolymerbürsten mit Azidgruppen in Serum keinerlei Aggregation.rnrnZellaufnahmestudien in dendritische Zellen zeigen nur im Falle einer Azid-funktionalisierten Poly(2-isopropyl-2-oxazolin)bürste eine unspezifische Aufnahme. Die hydrophileren Poly(2-oxazolin)bürsten weise keine unspezifische Aufnahme auf, was eine wichtige Anfoderung für die Verwendung als Polymercarrier in der Krebsimmuntherapie ist.rn

The controlled delivery of genes and drug therapeutics are a vital aspect of modern medicine. Inspired by naturally occurring polypeptides, poly-(2-oxazoline)s are excellent candidates for applications in the field of drug and gene delivery as their structure is similar to natural polypeptides. These synthetic polymers thus offer potential advantages to overcome current obstacles in drug and gene therapeutics in terms of cytotoxicity and efficiency. Cylindrical polymer brushes have become increasingly popular because of their anisotropic character and the recent results on the shape dependent endocytosis.rnrnHence, this work focuses on the synthesis and characterization of biocompatible poly(2-oxazoline) brushes as potential nanocarriers for the delivery of drugs, genes and other biomolecules. As first monomer 2-isopropyl-2-oxazoline was chosen as it exhibits a lower critical solution temperature of 37°C which seems to be an interesting property for conjugations and different biomedical applications. Macromonomers in the range of 1000-5000 g/mol were obtained by termination of the living cationic oxazoline polymerization with a primary functionalization step and subsequent transfer reactions to end up with methacrylamide end group. For the first time high molecular weight cylindrical brushes with poly(2-oxazoline) side chains and a contour length of 250 nm were synthesized by grafting through.rnAccording to the established synthesis route poly(2-oxazoline) homo and blockcopolymer brushes consisting of 2-ethyl-2-oxazoline and/or 2-isopropyl-2-oxazolin were prepared as well as brush polymers consisting of statistical copolymers of 2-ethyl-2-oxazolin and non-substituted 2-oxazoline. After selective cleavage of formyl rests the latter polymer brush offers imine units either for conjugation or after protonation for polyelectrolyte complexation. By the usage of azide functionalized initiators for the cationic oxazoline polymerization it is also possible to synthesize azide end group functionalized macromonomers, which can be polymerized by free radical polymerization too. Thus high molecular weight polymer brushes with a grafting and functional density of 100 % were obtained. Moreover the way of synthesis allows the characterization of all polymer brushes by static and dynamic light scattering in terms of absolute molecular weight and molecular dimensions. In further reactions the azide groups were utilized for dye labeling of the brushes by copper-free 1,3 dipolar addition (copper-free click-chemistry), which is an essential requirement for experimental in vitro and in vivo detection. In addition the polymer analogoues Staudinger reduction of the azide end groups was successful, leading to amine end groups of each side chain, which offers a versatile route for conjugation reactions and provides cationic charges, even at physiological pH, for complex formation with DNA and siRNA. rnFirst dynamic light scattering studies in human blood serum exhibit little aggregation of the amino end group functionalized brush polymers. Presumably the aggregation may be suppressed after appropriate conjugation reactions as the azid end group modified precursor brushes show nearly no aggregation in serum.rnCell studies show only for the pure azide-functionalized poly(2-isopropyl-2-oxazolin) an unspecific uptake into dendritic cells. In contrast, the more hydrophilic brushes are not unspecifically internalized. This is an important feature for the application as a polymeric carrier in cancer immunotherapy. rn