Die Rolle von Ephrin-B2 in der Invasion maligner Gliome

Das Glioblastoma multiforme zählt zu den häufigsten glialen Neoplasien des Menschen und weist zudem unter den Gliomen die höchste Malignität auf. Glioblastompatienten haben trotz aggressiver therapeutischer Ansätze eine mittlere Überlebenszeit von weniger als einem Jahr. Die diffuse Invasion in das umliegende Hirngewebe ist einer der Hauptgründe für die Rezidivbildung und die infauste Prognose von Glioblastompatienten. Neuere Untersuchungen lassen vermuten, dass die starke Invasion auch einer der Gründe für die beobachtete anti-angiogene Resistenz bei der Behandlung von Glioblastomen ist. Das bidirektionale EphB/Ephrin-B-System wurde bei der axonalen Wegfindung als Vermittler repulsiver Signale identifiziert und auch im Zusammenhang der Migration und Invasion von Zellen überprüft. In der vorliegenden Arbeit sollte daher die Funktion der bidirektionalen Eph- und Ephrin-Signaltransduktion in Bezug auf die Glioblastominvasion und Progression untersucht werden. rn Genetische und epigenetische Untersuchungen der EphB/Ephrin-B-Familie in einer Kohorte von Gliompatienten unterschiedlicher Malignitätsgrade identifizierten Ephrin-B2 als mögliches Tumorsuppressorgen. In Übereinstimmung damit führte die Inaktivierung von Ephrin-B2 in einem murinen Gliommodell zu einer verstärkten Invasion und einem erhöhtem Tumorwachstum in vivo. Dies konnte in verschiedenen Invasion-Assays in vitro bestätigt werden. Weiterhin zeigten unsere Untersuchungen, dass Ephrin-B2 transkriptionell durch das hypoxische Mikromilieu HIF-1α-vermittelt reprimiert wird. Da HIF-1α als transkriptioneller Aktivator Ephrin-B2 nicht direkt reprimieren kann, wurden potentielle HIF-1α-regulierte Repressoren untersucht, die für die Ephrin-B2 Herunterregulation verantwortlich sein könnten. Dabei wurde anhand von Ephrin-B2-Promotoranalysen und ChIP-Assays ZEB2 als HIF-1α-induzierbarer Repressor von Ephrin-B2 identifiziert. Zur Bestätigung der Hypothese, dass ZEB2 ein wichtiger Regulator der Tumorinvasion ist, wurden humane ZEB2-Knockdown-Glioblastomzellen generiert und in vitro sowie in vivo untersucht. Im Hinblick auf mögliche therapeutische Anwendungen wurden die ZEB2-Knockdown-Glioblastomzellen zusätzlich im Zusammenhang anti-Angiogenese-induzierter Invasion analysiert. Der Verlust von ZEB2 führte dabei zu einer verringerten Glioblastominvasion und Progression in einem Maus-Xenograft Modell. Die Behandlung der Tumoren mit dem anti-VEGF-Antikörper Avastin resultierte in einer stark erhöhten Invasion, die durch die Inaktivierung von ZEB2 und der dadurch reaktivierten repulsiven Signale von Ephrin-B2 wieder aufgehoben werden konnte. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass Ephrin-B2 als Tumorsuppressor in Gliomen agiert und durch verschiedene Mechanismen wie der genetischen und epigenetischen Kontrolle, aber auch der HIF-1α-vermittelten, ZEB2-abhängigen Repression inaktiviert wird. Dies resultiert in einer Blockade repulsiver Signale, so dass Tumorzellen diffus in das Parenchym und zu den Blutgefäßen migrieren können. Der in dieser Arbeit neu identifizierte Signalweg stellt ein attraktives therapeutisches Ziel zur Inhibition der Tumorzellinvasion dar und ermöglicht darüber hinaus der Ausbildung von Resistenzen gegenüber anti-angiogener Behandlung entgegenzuwirken. rn

Glioblastoma multiforme is the most common and most malignant glial neoplasia. Glioblastoma patients have a poor prognosis with a median survival time of less than a year, even with aggressive surgical, radio- and chemotherapeutic treatments. Diffuse invasion of the surrounding brain parenchyma is one of the main reasons for tumor relapse and thus a major obstacle in the treatment of glioblastoma. Recent evidence suggests that increased invasiveness also allows glioblastomas to evade anti-angiogenic therapies. The bidirectional EphB/ephrin-B system has been shown to mediate repulsive signals in axon pathfinding and may also control cell migration and invasion. The aim of this study was to decipher the role of the bidirectional Eph and ephrin signal transduction system in glioblastoma invasion and progression. rn Genetic and epigenetic analysis of the EphB/ephrin-B family in a panel of glioma biopsies of different grades revealed a potential tumor suppressor function of ephrin-B2. In support of this, loss of ephrin-B2 in a mouse glioma model accelerated tumor growth and invasion in vivo. These results were validated in various invasion assays in vitro. In addition to the genetic inactivation, ephrin-B2 expression could also be downregulated by a hypoxic microenvironment in a HIF-1α-dependent manner. Since HIF-1α is a transcriptional activator, we postulated an indirect mechanism of ephrin-B2 regulation and searched for putative HIF-1α-controlled transcriptional repressors that would block the expression of ephrin-B2. We identified ZEB2 as a HIF-1α-inducible repressor of ephrin-B2, as demonstrated by promoter transactivation analyses and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays. To examine whether ZEB2 could thus act as an important regulator of tumor invasion, human ZEB2-knockdown glioblastoma cells were generated and analyzed both in vitro and in vivo. With regard to possible future therapeutical applications, the tumor-bearing mice were additionally treated with anti-angiogenic agents. We found that ZEB2-silencing resulted in reduced growth and decreased invasion of human glioblastoma tumors in a mouse xenograft model. Treatment with the anti-VEGF antibody Avastin strongly increased invasion, but this effect was fully abolished following the knockdown of ZEB2 and the reactivation of ephrin-B2 repulsive signaling. rn In summary, this work demonstrates that ephrin-B2 acts as a tumor suppressor in glioma and gets inactivated through various mechanisms, including genetic deletion, epigenetic silencing and microenvironmental downregulation via HIF-1α-induced repression by ZEB2. The resulting cessation of repulsive signals represents a crucial initial step that promotes diffuse invasion into the parenchyma and along vascular scaffolds. This novel pathway may represent an attractive therapeutic target for inhibiting tumor invasion and counteracting tumor resistance mechanisms against current anti-angiogenic treatment strategies.rn