Untersuchungen zum Einfluss von NBN, ATM und ATR auf die Alkylanzien-induzierte Toxizität

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der DNA-Reparaturenzyme NBN, ATM und ATR, die wichtige Funktionen während der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) besitzen, auf die Alkylanzien-induzierte Toxizität untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass verschiedene menschliche Zelllinien, welche eine Beeinträchtigung in einem dieser drei Gene aufweisen, eine erhöhte Sensitivität gegenüber N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) und dem Chemotherapeutikum Temozolomid (TMZ) zeigen. Da das DNA-Reparaturenzym MGMT die Zellen vor der Induktion des Zelltods schützt, kann geschlussfolgert werden, dass die Hypersensitivität der mutierten Zelllinien auf die O6-MeG-Läsion zurückzuführen ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen von NBN oder ATM nicht zu einer verminderten Kapazität der Basen-Exzisions-Reparatur (BER) führen. Somit ist die erhöhte Sensitivität der mutierten Zellen sehr wahrscheinlich auf eine verminderte Reparatur der DSBs zurückzuführen, welche durch die O6-MeG-Läsion induziert werden. Damit konnte NBN, ATM und ATR als neue Faktoren in der Abwehr gegen Alkylanzien-induzierte Toxizität identifiziert werden. Dies ist von großer klinischer Bedeutung, da einerseits die drei Proteine als therapeutisches Angriffsziel Bedeutung gewinnen und andererseits verschiedene Tumore, die in der Klinik mit alkylierenden Agenzien behandelt werden, Mutationen in diesen Genen tragen.rnrnWeiterhin wurde beobachtet, dass NBN- und ATM-defiziente Zellen nach Behandlung mit methylierenden Agenzien eine ungewöhnlich hohe Nekrose-Rate aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass diese unabhängig von einer PARP1-Aktivierung induziert wird. Dennoch wurde in den NBN- und ATM-mutierten Zelllinien im Gegensatz zum Wildtyp eine sehr starke Verminderung der ATP-Menge nach MNNG-Behandlung beobachtet. Diese wird durch das Fehlen einer effektiven Aktivierung der AMP-Kinase in diesen Zellen verursacht. Somit kann angenommen werden, dass die hohe Nekrose-Rate auf eine ATP-Depletion zurückzuführen ist, welche durch die nicht ausreichende AMP-Kinase-Aktivierung in diesen Zellen bedingt wird. Daher konnte NBN und ATM als Faktoren des zellulären Schutzes gerichtet gegen die Induktion der „programmierten Nekrose“ identifiziert werden. Dies ist ebenfalls von klinischer Bedeutung. Tragen Tumorzellen von Tumoren, welche mit methylierenden Agenzien behandelt werden, Mutationen in einem dieser Gene, so muss mit einer vermehrten Induktion von Nekrose und daher mit einer Stimulierung des Immunsystems während der Chemotherapie gerechnet werden. Dies wäre einerseits mit erhöhten Nebenwirkungen, die sich insbesondere durch Entzündungsreaktionen äußern, verbunden. Andererseits zeigen verschiedene Arbeiten, dass die Stimulation des Immunsystems durch sterbende Tumorzellen während der Chemotherapie die Tumorregression positiv beeinflussen kann.

The DNA repair proteins NBN, ATM and ATR have important functions during the repair of DNA double-strand breaks (DSBs). In the present study the influence of these proteins on alkylating agent-induced toxicity was investigated. It was shown that different human cell lines, which carry mutations in one of these genes, display an increased sensitivity to the methylating agents N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine (MNNG) and temozolomide (TMZ). Because the repair enzyme MGMT protects against the induction of cell death, it can be concluded that the hypersensitivity is mainly due to the O6-MeG lesion. Additionally, it was shown that mutations in NBN or ATM do not lead to a decreased base excision repair (BER) capacity of the cells. The hypersensitivity is very likely caused by an impaired repair of O6-MeG-induced DSBs. Therefore, NBN, ATM and ATR were identified as new factors in the defence against toxicity induced by alkylating agents. This is of clinical interest, because on the one hand these proteins might be new therapeutic targets and on the other hand many tumours, which are treated with alkylating agents, carry mutations in these genes.rnrnAdditionally, it was observed that NBN- and ATM-deficient cells undergo high level of necrosis following treatment with methylating agents. It was shown that necrosis induction occurred independently of the activation of PARP1. Despite the absence of PARP1 activation and, in contrast to the wild type cells, a massive drop of the ATP level was observed in NBN- and ATM-mutated cells following treatment with MNNG. This ATP depletion is caused by the lack of an effective activation of the AMP-kinase in these cells. Therefore, it is very likely that the high level of necrosis induction is due to ATP depletion caused by the failure to activate the AMP kinase efficiently in these cells. In conclusion, NBN and ATM act also in the cellular defence against the induction of “programmed necrosis”, which is also of clinical interest. If tumour cells, which are treated with methylating agents, carry mutations in NBN or ATM, it is very likely that they undergo high level of necrosis following chemotherapy and therefore will stimulate the immune system. This would be accompanied by the induction of inflammation in the surrounding tissues. Otherwise, different studies show that the stimulation of the immune system by dying tumour cells during chemotherapy positively influences the tumour regression.