Analisi preclinica di nuove strategie terapeutiche basate sull'inibizione di protein-chinasi nell'osteosarcoma.

Scopo: L’obiettivo del presente programma di studio è stato quello di identificare e validare nuovi possibili bersagli terapeutici per l’osteosarcoma (OS) partendo dall’analisi del chinoma umano. Risultati: L’analisi del profilo di espressione genica ottenuta su 21 campioni clinici di OS ad alto grado di malignità ha permesso di selezionare le seguenti chinasi di possibile rilevanza biologica per l’OS: AURK-A, AURK-B, CDK2, PIK3CA, PLK-1. Le chinasi selezionate sono state validate tramite RNA interference. Successivamente è stata valutata l’efficacia dei relativi inibitori specifici: VX-680 e ZM-447439 inibitori delle Aurora-chinasi, Roscovitina di CDK2 e NMS1 di PLK-1, già inclusi in studi clinici. In termini d’inibizione della crescita cellulare le linee sono risultate maggiomente sensibili ai farmaci VX-680 e NMS1. E’ stata osservata una minor sensibilità ai farmaci VX-680, ZM447439 e NMS1 nelle linee doxorubicina(DX)-resistenti (caratterizzate da elevati livelli di espressione di ABCB1), indicando questi farmaci come potenziali substrati di ABCB1. La Roscovitina, nonostante i valori di IC50 elevati, non sembrerebbe substrato di ABCB1. La validazione preclinica di VX-680 e ZM447439 è stata completata. La forte inibizione della crescita è causata da endoreduplicazione per mancata citodieresi con conseguente formazione di una popolazione iperploide e apoptosi. Inoltre, VX-680 inibisce la motilità e la capacità di formare colonie. Esperimenti di associazione farmacologica mostrano che VX-680 interagisce positivamente con tutti i chemioterapici convenzionali impiegati nel trattamento dell’OS. NMS-1 produce interazioni positive con la DX in linee cellulari DX-resistenti, probabilmente grazie all’effetto revertante esercitato su ABCB1. La Roscovitina produce interazioni positive con CDDP e DX nelle varianti resistenti, effetto probbilmente dovuto al ruolo di CDK2 nei meccanismi di riparo del DNA. Conclusioni: L’analisi in vitro dell’attività degli inibitori ha permesso di identificare VX-680 come nuovo farmaco di potenziale interesse clinico, soprattutto in virtù delle sue interazioni sinergiche con i chemioterapici di uso convenzionale nel trattamento dell’osteosarcoma.

Background: Objective of this study was the preclinical validation of protein kinases and kinase inhibitors of possible clinical usefulness in osteosarcoma. Results: By mining genome-wide expression profiling data obtained from 21 osteosarcoma (OS) clinical samples, five protein kinases emerged as the most relevant for the osteosarcoma biology: AURK-A, AURK-B, CDK2, PIK3CA, PLK1. Theyr validation was perfomed by RNAinterference. We therefore investigated the efficacy of the following drugs: VX-680 and ZM447439 (AURKs inhibitors), the CDK2 inhibitor Roscovitine and the PLK1 inhibitor NMS-1, which have been included in clinical trials for other tumors. In terms of cell growth inhibition, VX-680 and NMS-1 proved to be the most effective among the tested drugs. A decrease of drug sensitivity was observed in doxorubicin-resistant cell lines (characterized by a high ABCB1 expression), suggesting VX-680, ZM447439 and NMS-1 as ABCB1 substrates. Roscovitine was less effective than other drugs but it did not appear to be affected by the ABC-mediated efflux mechanisms. Preclinical validation of VX-680 and ZM447439 has been completed. Cell growth inhibition was caused by occurring endoreduplication with cytokinesis failure and consequent generation of hyperploid populations. Generally, this alteration is followed by apotosis induction. VX-680 also decreased motility and soft-agar colony formation ability of human OS cells. Drug association experiments showed that VX-680 positively interacts with all drugs conventionally used in OS. NMS-1 proved a positive interaction with DX in DX-resistant cell lines, probabily due to the revertant effect of this drug on ABCB1 activity. Roscovitine produced positive interactions with CDDP and DX in resistant variants, probabily due to CDK2 role in DNA-damage repair pathway. Conclusions: These results indicate that kinases might represent new candidate therapeutic targets for OS and in vitro analysis of two inhibitors of AURK-A and AURK-B indicated in VX-680 a new promising drug of potential clinical usefulness to target these molecules.