Estudo químico e avaliação da atividade antimicrobiana de fungos endofíticos associados à Paepalanthus chiquitensis (eriocaulaceae) e efeitos de moduladores químicos epigenéticos no cultivo de Pochonia chlamydosporia

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Processo FAPESP: 2013/12564-6

Processo FAPESP: 2014/25181-0

Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas - FCFAR

Este trabalho apresenta os resultados da pesquisa de metabólitos secundários ativos produzidos por fungos endofíticos associados às partes aéreas (folhas, escapos e capítulos) de Paepalanthus chiquitensis (Eriocaulaceae). Entre os 25 fungos isolados da espécie de Eriocaulaceae, o Fusarium sp. foi o fungo mais promissor quanto à atividade antimicrobiana para as cepas de bactérias Gram-negativa Escherichia coli e Salmonella setubal, da bactéria Gram-positiva Staphylococus aureus e para a levedura Candida albicans resistente ao fluconazol, e ainda exibiu a capacidade bactericida e fungicida. Outro fungo selecionado foi o Bipolaris sp. isolado das folhas de P. chiquitensis devido a sua diversidade química. O cultivo dos fungos em Potato Dextrose Broth (PDB) em escala ampliada resultou no extrato acetato de etila (EAcOEt) que foram purificados por métodos cromatográficos em escala preparativa. A identificação/elucidação por métodos espectrométricos e espectroscópicos (EM, IV, UV, RMN mono e bidimensionais) forneceu as substâncias: 3,4-Piridinadiamina, N4-1-metil-5-(3'-buten-1-il) (S1), ácido fusárico (S2), 2-(1H-indol-6-il)-acético (S3), 2-Piridinametilamina-N8-metil-5-hexanoato (S4) e o sesterterpeno terpestacina (S5), Etanoato de etila-2-(2-acetil-4,6-diidroxifenil) (B4) e um alcalóide inédito na literatura (B1). Com este trabalho, observamos que os fungos endofíticos estudados possuem sua química completamente distinta quando comparada com as classes de substâncias isoladas de espécies vegetais de Eriocaulaceae, sendo uma importante fonte de novos produtos naturais com potencial atividade biológica. Este trabalho contempla também o estudo dos efeitos de modificadores epigenéticos e íons metálicos na diversificação metabólica do fungo Pochonia chlamydosporia (ATCC). A adição de ácido anacárdico (AA) no meio de cultivo líquido (PDB+AA) rendeu 2,6 vezes mais extrato do que o controle PDB. Os perfis químicos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e cromatografia em camada delgada (CCD) foram comparados, foi identificado que o radicicol é majoritário em todos os extratos analisados. Estes extratos foram submetidos à análise quantitativa por CLAE, o AA adicionado no meio líquido Potate Dextrose Agar (PDB) rendeu 4,6 vezes mais radicicol do que o controle PDB. O EAcOEt preparado do cultivo em escala ampliada em meio PDB + Mg2+ foi purificado por métodos cromatográficos em escala preparativa e resultou no isolamento e identificação das substâncias ausentes no controle (PDB), Poconinas B, E e L e também do mixostiol, substâncias (P1-P4) respectivamente.

This work presents the results of the research of active secondary metabolites produced by endophytic fungi associated with the aerial parts (capitulae, scapes and leaves) of Paepalanthus chiquitensis (Eriocaulaceae). Among the 25 species of fungi isolated from the specie of Eriocaulaceae, the Fusarium sp. was the fungus that showed the best biological activity against the strains of Gram-negative bacteria Escherichia coli and Salmonella setubal, the Gram-positive bacterium Staphylococus aureus and Candida albicans yeast resistant to fluconazole. The Fusarium sp also displayed bactericidal and fungicidal effects. The research also presents the chemical studies of the fungus Bipolares sp., isolated from the leaves of P. chiquitensis which was selected due to its chemical profile. The large scale cultivation of both fungi afforded the respective ethyl acetate extracts which were purified by preparative chromatography methods. The chemical structures were elucidated by spectrometric and spectroscopic methods (MS, IR, UV, mono- and bidimensional NMR affording the following substances from the Fusarium sp.: 5-(but-3-en-1-yl)-N4-methylpyridine-3,4-diamine (S1), fusaric acid (S2), 2-(1H-indol-6-yl)-acid (S3), 5-Butil-2-pyridinecarboxamide (S4) and the sesterterpene fusaproliferin (S5), while for the Bipolaris sp.: Acetic acid, (2-acetyl-3,5-dihydroxyphenyl)-, ethyl ester (B4) and a new alkaloid (B1). Herein, we also showed the study of the effects of epigenetic modifiers and metal ions in metabolic diversity from the fungus Pochonia chlamydosporia (ATCC). The presence of anacardic acid in the liquid medium afforded 2.6 times more ethyl acetate extract compared with the PDB (Potato Dextrose Broth) control. Besides, the analysis by analytical HPLC (High Performance Liquid Chromatography) identified the radicicol as the major compound present in EtOAc extracts and showed that when anacardic acid (AA) is added to the liquid medium, there is a production of 4.6 times more of the radicicol than the PDB control. This fungus was cultivated in large scale in PDB + Mg2+, yielding four compounds absent in thePDB control: pochonins B, E and L and the myxostiol compounds (P1-P4), respectively.