Expressão, purificação e estudos estruturais da chaperona molecular Hsp65 de Mycobacterium leprae & caracterização da proteína NUDEL - nuclear distribuition element-like

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Pós-graduação em Microbiologia - IBILCE

A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp´s). A principal função das Hsp´s é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal,...

Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below)