Identificação de espermatozóides portadores do cromossomo X em búfalos (Bubalus bubalis)

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

A fração de espermatozóides X ou Y foi separada por centrifugação em nove diferentes gradientes de Percoll com densidades que variavam entre 0,9 a 1,06g/mL que foi obtida através de solução “stock” de Percoll composta de 11 partes de Percoll em 1 partes de solução contendo KCl (1M), NaH2PO4 (0,1M), NaCl (1,5M) e HEPES sódico (23,8g/mL). Para preparação dos nove diferentes gradientes de Percoll adicionou-se à solução stock a Solução A (do diluente glicina-gema) em diferentes partes. O sêmen foi centrifugado em Percoll 80% em 200xg por 10 minutos, o “pellet” foi depositado sobre os nove gradientes de Percoll, centrifugado a 100xg por 30 minutos. O novo “pellet” formado foi lavado em TES, mesmo diluente em que foi suspendido para congelação, juntamente com os espermatozóides suspendidos foi congelado sêmen fresco apenas diluído em meio TES para controle. Os espermatozóides descongelados do controle e do sêmen tratado foram corados com quinacrina mostarda e quantificadas 200 células para obtenção do percentual de espermatozóides portadores do Corpúsculo-F, observando uma diferença média 17,5% entre o grupo tratado e o controle. A centrifugação apresentou, através de seleção, uma melhora de motilidade, vigor e cauda fortemente dobrada significativa para as partidas que obtiveram boa congelação, quando comparados o grupo tratado ao controle, sem alteração significativa de defeitos de cauda dobrada, peça intermediária e integridade de membrana e com aumento significativos de alterações de acrossôma. Pode-se concluir que a técnica desenvolvida mostrou-se viável para separação de espermatozóides portadores de X dos portadores de Y a serem utilizados em técnicas de IA e principalmente em FIV, eliminando a necessidade de capacitação empregada na técnica.

The spermatozoa portion X or Y were separated by centrifugation in nine Percoll’s density gradients, ranging from 0.9 to 1.06mg/mL. These gradients were obtained using the Percoll stock and a solution containing KCl (1M), NaH2PO4 (0,1M), NaCl (1,5M) and HEPES sodium (23.8g/mL) in the proportion of 11 parts of Percoll and 1 part of the tampon solution. In order to prepare the nine different Percoll’s gradients were added to the Percoll stock the A solution (glycine-yolk) in different proportions. To retire the spermatozoa were used 0.7mL of the buffaloes semen, centrifuged in a 80% Percoll solution for 10 minutes in 200xg, the obtained pellet were put in the nine Percoll’s gradients wich was centrifuged for 30 minutes in 100xg. The new pellets were washed by centrifugation in TES extender and suspended for freezing with the control (fresh semen diluted in TES extender). The frozen-thawed spermatozoa of the control and the treatment group were colored by quinacrine mustard and counted (200 cells), in order to find the spermatozoa percentage with the F-Body, showing a mean difference of 17.5% between the control and the treatment group. The centrufugation showed, through a selection, an improved value of motility, vigor and coiled tails in lot of good freezers when comparing the treatment group with control, whithout no difference were observed in the pathologic defects as simple bent tails, middle piece and membrane integrity with a significant higher levels of acrosome alterations. In conclusion, the technique developed to separated the X and Y spermatozoa was feasible and useful for the AI and, mostly, in IVF technique in which is dispensable to induce the capacitation of the spermatozoa.