Desenvolvimento de um método de análise digital para o teste do cometa corado pela prata

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Pós-graduação em Patologia - FMB

O teste do cometa é utilizado para estimativa de dano ao DNA nos protocolos de avaliação do risco toxicológico. É rápido, de baixo custo, de fácil realização, seguro e pode ser aplicado em diversos tecidos. Corantes fluorescentes são os mais empregados para o ensaio. É também descrita a utilização de sais de prata com vantagens operacionais, carecendo de sistemas automatizados validados para esta análise. Neste trabalho, desenvolveram-se dois algoritmos automatizados para a análise do cometa corado pela prata. Foram realizados ensaios do cometa para sete grupos com dois camundongos Balb/c machos cada, submetidos ao tratamento intraperitoneal com soro fisiológico (G1), e três doses crescentes de genotóxicos conhecidos: MNU (N-nitroso-N-metilurea) (G2 – 5 μg/g, G3 – 25 μg/g, G4 – 50 μg/g) e DEN (N-nitrosodietilamina) (G5 – 20 μg/g, G6 – 80 μg/g, G7 – 180 μg/g). As lâminas dos testes do cometa foram confeccionadas a partir do sangue total e coradas pela prata e SYBR Gold. As coradas pela prata foram analisados por três avaliadores e pelos algoritmos automatizados. Aqueles corados pela fluorescência foram analisados pelo software Comet IV®. Os avaliadores apresentaram alta correlação de suas estimativas. Os algoritmos se correlacionaram fortemente com a análise dos avaliadores, principalmente com os escores obtidos pela classificação visual. Houve alta concordância na avaliação da sua repetitividade. Os algoritmos apresentaram resultados semelhantes, não indicando superioridade entre si para a análise do teste. Todos os métodos avaliados se mostraram capazes de diferenciar as concentrações dos genotóxicos utilizados. Porém, os algoritmos desenvolvidos não apresentaram correlação com os resultados obtidos pelo sistema do teste do cometa corado pela fluorescência, sugerindo que os métodos de coloração discriminem diferentes estruturas...

The comet assay is used to estimate DNA damage in the protocols for toxicological risk assessment. It's fast, inexpensive, easily performed, safe and can be applied in most tissues. Fluorescent dyes are frequently used for testing. Silver salts have been reported with some operational advantages; however automated systems for its analysis were not sufficiently validated for this staining. In this study, we have developed two algorithms for automated analysis of the comet assay silver stained. The assay was performed for seven groups of two (Balb/c) mice each, treated with intraperitoneal saline (G1) and three different genotoxic doses: MNU (N-nitroso-N-methylurea) (G2 - 5 μg/g, G3 - 25 μg/g, G4 - 50 μg/g) and DEN (N-nitrosodiethylamina) (G5 - 20 μg/g, G6 - 80 μg/g, G7 - 180 μg/g). The slides of the comet assay were made with total blood and were stained with silver and SYBR Gold. The silver stained slides were analyzed by three evaluators and the automated algorithms. Those stained by fluorescence were analyzed through software Comet IV®. Evaluators showed high correlation of their estimates. Both algorithms were correlated strongly with the evaluators' analysis mainly on the scores obtained by visual classification. Moreover, their agreement was high when assessed by repetitivity. The algorithms showed similar results, demonstrating no superiority to each other for the analysis of the test. All methods evaluated proved able of differentiating genotoxic concentrations used. However, the algorithms were not correlated with the results obtained by the automated system of comet assay fluorescence stained, suggesting that the staining methods linkage different genomic structures or with different affinities. The automated algorithms developed proved valid for the direct analysis of comet assay silver stained, allowing their use in genotoxicity research