Proteínas quinases de Neurospora crassa envolvidas na regulação do metabolismo de glicogênio: identificação das provavéis quinases que fosforilam a enzima glicogênio sintase

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Neste trabalho, uma coleção de linhagens mutantes de N. crassa em proteínas quinases foi adquirida pelo nosso laboratório e estas linhagens foram utilizadas a fim de identificar as proteínas envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio no fungo. Estas proteínas foram anotadas como pertencentes a diferentes classes de proteínas quinases devido às características dos seus domínios quinases. Inicialmente foram identificadas as quinases que estão envolvidas no controle do metabolismo do carboidrato através da quantificação do conteúdo de glicogênio, tanto em uma situação de crescimento vegetativo (30 °C), como sob a condição de estresse térmico (45 °C). Nesta parte, as linhagens mutantes que mostraram perfis de acúmulo de glicogênio diferente da linhagem selvagem, nas condições avaliadas foram selecionadas. Posteriormente, foram realizadas quantificações de atividade da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN), sob as mesmas condições experimentais, na presença e ausência do modulador alostérico glicose-6-fosfato (G6P). Foi verificado que a enzima GSN presente em algumas linhagens mutantes provavelmente estaria diferentemente fosforilada, quando comparada à proteína presente na linhagem selvagem. Por este motivo, uma análise das diferentes isoformas de fosforilação foi realizada em algumas das linhagens mutantes combinando os ensaios 2D-PAGE e Western blot. Através destas análises foi possível verificar quais proteínas quinases estão envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio e que atuam mais especificamente na regulação por fosforilação da enzima GSN. Das 55 linhagens inicialmente utilizadas, 6 linhagens apresentaram diferenças no acúmulo de glicogênio, na atividade GSN e no estado de fosforilação da enzima GSN, quando comparadas com a selvagem. Portanto, caracterizam proteínas...

In this work, a collection of N. crassa strains mutated in genes encoding protein kinases was used to identify proteins involved in the control of glycogen metabolism in this fungus. These proteins were annotated as belonging to different classes of protein kinases due to their kinase domains. Initially, we identified the proteins involved in the metabolism control by quantifying the glycogen accumulated under vegetative growth (30 °C) and under a stress condition such as heat stress (45 °C). The mutant strains showing glycogen accumulation profiles different from the wild-type strain under the conditions evaluated were selected. The selected mutant strains were used to quantify glycogen synthase activity (GSN), under the same experimental conditions, in the presence and absence of the allosteric modulator glucose-6-phosphate (G6P). From this assays, it was observed that GSN in some mutant strains would be differently phosphorylated when compared to the enzyme present in the wild-type strain. Therefore, an analysis of the GSN phosphorylation isoforms was performed in such mutant strains by combining 2D-PAGE and Western blot. Through these analysis, it was possible to identify which protein kinases are involved in the control of glycogen metabolism and specifically act in the GSN phosphorylation. Of the 55 strains initially used six strains showed differences in the glycogen accumulation, in the GSN activity, and in the state of GSN phosphorylation, compared to the wild-type strain. Therefore, they characterize putative protein kinases that regulate glycogen metabolism by regulating the GSN enzyme. The strain knocked-out in the ORF encoding the protein PHO85-like (a cyclin-dependent protein kinase) showed differences in the glycogen content, increased -/+ G6P ratio, and changes in the GSN phosphorylation... (Complete abstract click electronic access below)