Caracterização de dois cDNAs homológos e uma AP endonuclease em cana-de-açúcar

The genome of all organisms is subject to injuries that can be caused by endogenous and environmental factors. If these lesions are not corrected, it can be fixed generating a mutation which can be lethal to the organisms. In order to prevent this, there are different DNA repair mechanisms. These mechanisms are well known in bacteria, yeast, human, but not in plants. Two plant models Oriza sativa and Arabidopsis thaliana had the genome sequenced and due to this some DNA repair genes have been characterized. The aim of this work is to characterized two sugarcane cDNAs that had homology to AP endonuclease: scARP1 and scARP3. In silico has been done with these two sequences and other from plants. It has been observed domain conservation on these sequences, but the cystein at 65 position that is a characteristic from the redox domain in APE1 protein was not so conservated in plants. Phylogenetic relationship showed two branches, one branch with dicots and monocots sequence and the other branch with only monocots sequences. Another approach in order to characterized these two cDNAs was to construct overexpression cassettes (sense and antisense orientation) using the 35S promoter. After that, these cassettes were transferred to the binary vector pPZP211. Furthermore, previously in the laboratory was obtained a plant from nicotiana tabacum containing the overexpression cassette in anti-sense orientation. It has been observed that this plant had a slow development and problems in setting seeds. After some manual crossing, some seeds were obtained (T2) and it was analyzed the T2 segregation. The third approach used in this work was to clone the promoter region from these two cDNAs by PCR walking. The sequences obtained were analyzed using the program PLANTCARE. It was observed in these sequences some motives that may be related to oxidative stress response

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

O genoma de todos os organismos está sujeitos a lesões que podem ser causados por fatores endógenos e ambientais. Uma vez no genoma, as lesões podem levar a formação e acúmulo de mutações, as quais podem ser prejudiciais ao desenvolvimento do organismo. As vias de reparo de DNA são um mecanismo que permite o organismo detectar e corrigir essas lesões ou minimizar seus efeitos. Várias vias de reparo de DNA são conhecidas e bem caracterizadas em animais e microorganismos. Em plantas, as vias de reparo ainda não são bem caracterizadas, mas muitas pesquisas têm revelado a participação de todas as vias conhecidas no reparo do genoma das plantas, sendo os modelos mais estudados Arabidopsis thaliana e Oriza sativa. A via de reparo de interesse deste trabalho é a via de BER, a qual apresenta várias proteínas atuando no reparo do DNA. Porém, a classe de proteínas da via BER focadas são as AP endonucleases, responsáveis pela hidrólise do sítio AP. Este trabalho teve como objetivo caracterizar dois cDNAs de cana-de-açúcar: scARP1 e scARP3, homólogos a AP endonucleases de A.thaliana e identificados num trabalho de data-mining do projeto SUCEST. Para tanto, foram construídos cassetes de super-expressão, contendo o cDNA scARP1 sob o controle do promotor forte 35S. Além disso, anteriormente no laboratório foi obtido uma planta de icotiana tabacum contendo o cassete de super-expressão (35S+scARP1) em orientação anti-senso. Foi analisado o desenvolvimento desta planta, e foram obtidas também algumas sementes (T2) desta planta. Estas sementes foram germinadas e analisadas quanto à presença do cassete de super-expressão e desenvolvimento. Além disso, para estes dois genes foram clonados as regiões promotoras por PCR walking. Os fragmentos obtidos foram clonados, sequenciados e, analisados por meio do programa PLANTCARE. Os motivos encontrados nessas regiões dos genes de cana-de-açúcar foram comparados com potenciais regiões promotoras das plantas de Arabidopis, O. sativa e S. bicolor. Estas análises mostraram a presença de diferentes motivos relacionados à respostas ao estresse oxidativo