Efeito da adição de colesterol e ecdisona na produção in vitro do baculovírus spodoptera frugiperda MNPV

Among the pests that attack corn crop in Brazil, there is Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), known as fall armyworm, which is the major corn pest. Due to genetic instability during serial passage of baculoviruses in insect cell culture, the viral bioinseticides in vitro production development is the greatest challenge for mass production of this bioproduct. Successive passages of virus using extracellular viruses (BVs), necessary during viral bioinseticides production scaling up, leads to the appearance of aberrant forms of virus, a process so called as "passage effect ". The main consequence of passage effect is the production of occlusion bodies (OB) decrease, preventing its production using in vitro process. In this study, it was carried out a serial passage of baculovirus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus, isolate 18, using Sf21 cells. A decrease in the production of occlusion bodies from 170 to 92 in the third to fourth passage was observed. A factorial experimental design (22) was employed to verify the influence of two input variables, concentration of the hormone 20 - hydroxyecdysone (CH) and cholesterol (CC) on the values of response variables (volumetric and the specific OB production) of the process, seeking to define the optimum operating ranges trying to reverse or minimize the passage effect. The result indicated a negative influence of the cholesterol addition and positive effect in the hormone supplementation which the optimum range found for the concentrations studied were 8 to 10μg/mL and 5 to 6.5 mg / mL, for cholesterol and hormone concentrations respectively. New experiments were performed with addition of hormone and cholesterol in order to check the influence of these additives on the OB production independently. While the best result obtained from the factorial experiment was 9.4 x 107 OB/mL and 128.4 specific OB/cell, with the addition of only 6μg/mL 20-hydroxyecdysone these concentrations increased to 1.9 x 108 OB/mL and 182.9 OB/cell for volumetric and specific OB production, respectively. This result confirms that the addition of the hormone 20-hydroxyecdysone enhances the SfMNPV in vitro production process performance using Sf21 cells

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Dentre as pragas que atacam a cultura do milho no Brasil, destaca-se a Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), conhecida no estádio larval como lagarta-do-cartucho, considerada a praga chave da cultura, alimentando-se da planta em todas as suas fases de crescimento, principalmente dos cartuchos de plantas jovens. Para seu controle, tem-se empregado inseticidas químicos de amplo espectro, o que tem causado efeitos adversos ao homem e ao meio ambiente. Por essa razão, torna-se necessária a busca de alternativas mais eficientes, de baixo custo e de fácil utilização, como o uso de bioinseticidas, especialmente os baculovírus. Devido à instabilidade genética durante a passagem seriada de baculovírus em cultivo de células de inseto, o desenvolvimento da produção in vitro de bioinseticidas virais é o maior desafio para a sua produção massal. Passagens sucessivas de vírus usando vírus extracelulares (BVs), necessárias para o aumento de escala durante a produção de bioinseticida viral, leva ao aparecimento de formas aberrantes de vírus, processo conhecido como efeito de passagem . A principal consequência do efeito passagem é a diminuição da produção de corpos de oclusão (OB), inviabilizando economicamente sua produção pelo processo in vitro. Neste trabalho, foi realizada a passagem seriada do isolado 18 do baculovírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus em células Sf21. Foi observada uma queda na produção de OB de 170 para 92 da terceira para quarta passagem. Um planejamento experimental fatorial (22) foi empregado para verificar a influência de duas variáveis de entrada, concentração de hormônio 20- Hidroxiecdisona (CH) e concentração de colesterol (CC), sobre os valores das variáveis de resposta do processo (produção volumétrica e produção específica de OB), procurando definir as faixas ótimas de operação para reverter ou minimizar o efeito passagem. O resultado deste planejamento indicou influência negativa da adição do colesterol e positiva na adição de hormônio, onde as faixas ótimas encontradas para as concentrações estudadas foram: 8 a 10μg/mL e 5 a 6,5μg/mL, para as concentrações de colesterol e hormônio, respectivamente. Novos experimentos foram realizados com a adição individual de hormônio e colesterol com a finalidade de verificar a influência destes adjuvantes na produção de OB de forma independente. No planejamento experimental obteve-se produção volumétrica de 9,4 x 107 OB/mL e específica de 128,4 OB/célula. Quando se adicionou 6 μg/mL de 20-Hidroxiecdisona, as concentrações elevaram-se para 1,9 x 108 OB/mL e 182,9 OB/célula, indicando que a adição do hormônio melhorou a eficiência da produção in vitro de produção de SfMNPV em cultivos de células Sf21