Extração, caracterização e atividades biológicas de proteínas da espécie cnidoscolus urens (L.) Arthur

The extraction, chemical and structural characterization of a wide variety of compounds derived from plants has been a major source of bioactive molecules. Several proteases have been isolated in the plant kingdom, with numerous pharmacological and biotechnological applications. Among the proteases isolated from plants, are the fibrinogenolytic, with relevant application in the treatment of disorders in the coagulation cascade, in addition to potential use as a tool in clinical laboratories. In this study, in addition to evaluating the effects of the protein extract of Cnidoscolus urens (L.) Arthur (Euphorbiaceae) in the coagulation cascade also investigates the presence of antimicrobial activity and characterizes the proteolytic activity detected in this extract, aiming to determine their potential pharmacological and biotechnological application. In this way, crude protein extracts obtained from the leaves of C. urens in Tris-HCl 0.05M, NaCl 0.15M, pH 7.5, were precipitated in different concentrations of acetone, and assessed for the presence of proteolytic activity in azocaseína and fibrinogen. The most active fraction (F1.0) in these tests was chosen for assessment of biological activity and biochemical characterization. The Aα chain and Bβ of fibrinogen were completely cleaved at a concentration of 0.18 μg/μL of protein fraction in 4 minutes. Fibrinogenolytic activity presented total inhibition in the presence of E-64 and partial in the presence of EDTA. The fraction demonstrated coagulant activity in plasm and reduced the APTT, demonstrating acting on the factors coagulation of the intrinsic pathway and common, not exerting effects on the PT. Fibrinolytic activity on plasma clot was detected only in SDS-PAGE in high concentrations of fraction, and there were no defibrinating. Although several proteases isolated from plants and venomous animals are classically toxic, the fraction F1.0 of C. urens not expressed hemorrhagic nor hemolytic activities. Fraction F1.0 also showed no antimicrobial activity. In proteolytic activity on the azocasein, the optimal pH was 5.0 and optimum temperature of 60ºC. The enzyme activity has been shown to be sensitive to the presence of salts tested, with inhibition for all compounds. The surfactant triton did not influence the enzyme activity, but the tween-20 and SDS inhibited the activity. In the presence of reducing agents increase in enzyme activity occurred, a typical feature of enzymes belonging to the class of cysteine proteases. Several bands with proteolytic activity were detected in zymogram, in the region of high-molecular-weight, which were inhibited by E-64. In this study, we found that C. urens presents in its constitution cysteine proteases with fibrinogenolytic and procoagulant activity, which may be isolated, with potential application in treatment of bleeding disorders, thrombolytic and clinical laboratory

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

A extração, caracterização química e estrutural de uma grande diversidade de compostos derivados de plantas tem sido uma fonte importante de moléculas bioativas. Diversas proteases têm sido isoladas no reino vegetal, com inúmeras aplicações farmacológicas e biotecnológicas. Dentre as proteases isoladas de plantas, estão as fibrinogenolíticas, com relevante aplicação no tratamento de distúrbios na cascata da coagulação, além do uso em potencial como ferramenta em laboratórios clínicos. Neste trabalho, além de avaliar os efeitos do extrato protéico de Cnidoscolus urens (L.) Arthur, pertencente à família Euphorbiaceae, na cascata de coagulação, também se investigou a presença de atividade antimicrobiana e caracterizou a atividade proteolítica detectada neste extrato, tendo como objetivo determinar sua potencial aplicação farmacológica e biotecnológica. Desse modo, extratos protéicos brutos obtidos das folhas de C. urens em tampão Tris-HCl 0,05M, NaCl 0,15M, pH 7,5, foram precipitados em diferentes concentrações de acetona, e avaliados quanto a presença de atividade proteolítica em azocaseína e fibrinogênio. A fração mais ativa (F1.0) nestes testes foi escolhida para realização de avaliação de atividade biológica e caracterização bioquímica. As cadeias Aα e Bβ do fibrinogênio foram completamente clivadas na concentração de 0.18 μg/μL de proteína da fração em 4 minutos. A atividade fibrinogenolítica apresentou inibição total em presença de E-64 e parcial em presença de EDTA. A fração demonstrou atividade coagulante sobre o plasma e reduziu o tempo de tromboplastina parcial ativada, indicando atuar sobre os fatores da via intrínseca e comum da coagulação, não exercendo efeitos sobre o tempo de protrombina. A atividade fibrinolítica sobre o coágulo de plasma foi detectado apenas em SDS-PAGE em concentrações elevadas da fração, e apesar da atividade fibrin(ogen)olítica, não foi observada atividade defibrinogenante in vivo. Apesar de várias proteases de plantas e animais peçonhentos serem classicamente tóxicas, a fracção F1.0 não expressou atividade hemorrágica nem hemolítica. A fração F1.0 também não demonstrou atividade antimicrobiana. Na avaliação da atividade proteolítica sobre a azocaseína, o pH ótimo de reação foi 5.0, e a temperatura ótima igual a 60ºC. A atividade enzimática demonstrou ser sensível à presença dos sais testados, com inibição para todos os compostos. O tensoativo triton não influenciou a atividade enzimática, porém o tween-20 e SDS inibiram tal atividade. Em presença de agentes redutores ocorreu aumento da atividade enzimática, característica típica de enzimas pertencentes à classe das cisteíno proteases. Diversas bandas protéicas com atividade proteolítica foram detectadas em zimograma, na região de elevada massa molecular, que foram inibidas por E-64. Neste trabalho, foi revelado que C. urens apresenta fração enriquecida com cisteíno-proteases que apresentam atividade fibrinogenolítica e procoagulante, que podem ser isoladas, com potencial aplicação no tratamento de distúrbios hemorrágicos, como trombolítico e em laboratório clínico

2020-01-01