Produção e avaliação de nanoemulsão catiônica como possível vetor não-viral para pIRES2-EGFP

Gene therapy is based on the transfer of exogenous genetic material into cells or tissues in order to correct, supplement or silencing a particular gene. To achieve this goal, efficient vehicles, viral or non-viral, should be developed. The aim of this work was to produce and evaluate a nanoemulsion system as a possible carrier for no-viral gene therapy able to load a plasmid model (pIRES2-EGFP). The nanoemulsion was produced by the sonication method, after been choose in a pseudo-ternary phase diagram build with 5 % of Captex 355®, 1.2 % of Tween 80®, 0.8 % of Span 80®, 0.16% of stearylamine and water (to 100 %). Measurements of droplet size, polydispersity index (PI), zeta potential, pH and conductivity, were performed to characterize the system. Results showed droplets smaller than 200 nm (PI < 0.2) and zeta potential > 30 mV. The formulation pH was near to 7.0 and conductivity was that expected to oil in water systems (70 to 90 μS/s) A scale up study, the stability of the system and the best sterilization method were also evaluated. We found that the system may be scaled up considering the time of sonication according to the volume produced, filtration was the best sterilization process and nanoemulsions were stable by 180 days at 4 ºC. Once developed, the complexation efficiency of the plasmid (pDNA) by the system was tested by agarose gel electrophoresis retardation assay.. The complexation efficiency increases when stearylamine was incorporated into aqueous phase (from 46 to 115 ng/μL); regarding a contact period (nanoemulsion / pDNA) of at least 2 hours in an ice bath, for complete lipoplex formation. The nanoemulsion showed low toxicity in MRC-5 cells at the usual transfection concentration, 81.49 % of survival was found. So, it can be concluded that a nanoemulsion in which a plasmid model was loaded was achieved. However, further studies concerning transfectation efficiency should be performed to confirm the system as non-viral gene carrier

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

A terapia gênica consiste na transferência de material genético exógeno para células ou tecidos no intuito de corrigir, suplementar ou silenciar um determinado gene. Para que este objetivo seja alcançado, eficientes veículos carreadores devem ser desenvolvidos: virais ou não-virais. O objetivo deste trabalho foi produzir e avaliar um sistema nanoemulsionado como possível veículo não-viral para terapia gênica, capaz de veicular um modelo plasmidial (pIRES2-EGFP). A nanoemulsão foi produzida pelo método de sonicação, após ser escolhida em um digrama de fases pseudo-ternário. A formulação é constituída de 5 % de Captex 355®, 1,2 % de Tween 80®, 0,8 % de Span 80®, 0,16 % de estearilamina e água (qsp 100 %). O sistema foi caracterizado quanto ao tamanho de gotícula, índice de polidispersão (PI), potencial zeta, pH e condutividade. Os resultados mostraram gotículas menores que 200 nm (PI < 0,2) e potencial zeta > 30 mV em uma formulação de pH próximo a 7,0 e condutividade compatível a formulações de óleo em água (70 90 μS/s). A possibilidade de escalonamento, a estabilidade do sistema e a melhor forma de esterilização também foram avaliadas onde observou-se que o sistema pode ser escalonado adequando o volume produzido ao tempo de sonicação e a forma mais eficiente de esterilização foi a filtração em membrana. O sistema apresentou estabilidade maior que 180 dias quando armazenado a 4 ºC. Uma vez desenvolvido, o sistema foi testado quanto à capacidade de compactar o modelo plasmidial (pDNA). Eletroforese em gel de agarose foi a metodologia empregada para este fim, onde verificou-se que o poder de compactação aumenta (de 46 para 115 ng/μL) quando a estearilamina é incorporada na fase aquosa, respeitando um período de contato (nanoemulsão/pDNA) de pelo menos 2 horas, em banho de gelo. A nanoemulsão mostrou-se pouco tóxica nas concentrações usuais para ensaios de transfecção em células do tipo MRC-5, apresentando 81,49 % de viabilidade celular. Portanto, o processo de produção de um sistema que complexa eficientemente o modelo plasmidial foi obtido. Contudo, estudos de eficiência de transfecção devem ser conduzidos para confirmar o sistema como um carreador não-viral de material genético