Purificação e caracterização de uma β-glucuronidase extraída do molusco mesogastropoda ampularidade Pomacea sp

This work studies the involved enzymatic way in the metabolism of glycosaminoglycans sulfateds in the mollusc Pomacea sp. Had been identified endoglycosidases and exoglycosidases in the enzymatic extract of the mollusc Pomacea sp by means of hydrolysis activity in condroitim sulphate of whale cartilage and of the p-Nitrofenil-β-glucuronide, respectively. The enzymatic extracts qere obtained of Pomacea sp. being used of 0.1 sodium acetate buffer, pH 5.0 and later centrifugated the 8,000 x g and the presents proteins in the sobrenadante were submitted to the fractionament with two crescents ammonium sulphate concentrations, the visualized activity biggest in the F2 fraction (50-80%). The β-glucuronidase (F3) was isolated in gel chromatography filtration Biogel 1.5m, the purification degree was ratified in Chromatography Liquid of high efficiency (HPLC). The enzyme was purificated 6.362,5 times with 35,6% yield. The β -glucuronidase isolated in this work showed a molecular mass of 100 kDa, determined for eletroforese in poliacrilamida gel . The determination of the ideal kinetic parameters for the catalysis of the p-nitrofenil- β -glucuronide for β-glucuronidase, showed excellent activity in pH 5,0 and temperature 65ºC for 6 hours and apparent Km of 72 x 10-2 mM. It is necessary for the total degradation of 3mM of p-N-β-glucoronide, the amount of 1,2μg of ss-glucuronidase. The BaCl2 increased the activity of ss-glucuronidase, and the activity was inhibited completely by the composites SDS and NaH2PO4

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Esse trabalho estuda a via enzimática envolvida no metabolismo de glicosaminoglicanos sulfatados no molusco Pomacea sp. Foram identificadas atividades exo e endoglicosidásicas no extrato protéico do molusco Pomacea sp por meio de hidrólise do p-Nitrofenil-β-glucuronídeo e atividade em condroitim sulfato de cartilagem de baleia, respectivamente. O tecido obtido do molusco foi homogeneizado a 4ºC com tampão acetato de sódio, em seguida centrifugado a 8.000 x g e a proteína presente no sobrenadante foi submetida ao fracionamento com crescentes concentrações de sulfato de amônio, sendo a atividade glicosidásica maior visualizada na fração F2 (50-80%). A β-glucuronidase (F3) foi isolada em cromatografia de gel filtração Bio-gel A 1.5m, o grau de purificação de 6.362,5 vezes foi ratificado em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com um rendimento de 35,6%. A β-glucuronidase isolada neste trabalho apresenta uma massa molecular de 100 kDa, determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida. A determinação dos parâmetros cinéticos ideais para a catálise do p-nitrofenil-ß-glucuronídeo pela β-glucuronidase, apresentou atividade ótima em pH 5,0 e temperatura de 65ºC por 4 horas e um Km aparente de 72 x 10-2 mM. São necessárias para a degradação total de 3mM de p-N-β-glucuronídeo, a quantidade de 1,2mg de β-glucuronidase. O BaCl2 aumentou a atividade da β-glucuronidase e a atividade foi inibida completamente pelos compostos SDS e NaH2PO4