Epstein-Barr-viruksen antigeeniosoitustestin kehittäminen

Epstein-Barr-virus (EBV) aiheuttaa mononukleoosia eli pusutautia, joka ilmenee yleensä murrosiällä tai nuorella aikuisiällä. Mononukleoosissa on tyypilliset nielutulehduksen oireet, minkä takia sitä on vaikea erottaa muiden taudinaiheuttajien aiheuttamista nielutulehduksista. Erotusdiagnostiikan käyttö nielutulehduksessa on oleellista, koska vain Streptokokki-bakteerien aiheuttamat nielutulehdukset vaativat antibioottihoitoa. Akuutin EBV-infektion pikadiagnostiikka perustuu nykyisellään infektion seurauksena muodostuvien heterofiilisten vasta-aineiden mittaamiseen verestä. Niiden mittaamisessa on useita ongelmia, koska useilla lapsilla niitä ei muodostu lainkaan ja vanhemmillakin niitä muodostuu yleensä vasta viikon päästä mononukleoosin oireiden alkamisesta. Mittaamalla EBV:n antigeeneja saataisiin positiivinen testitulos vasta-ainetestiä nopeammin. EBV:lle ei ole kuitenkaan kehitetty antigeeniosoitustestiä todennäköisesti siksi, että EBV:n erittymisen terveiden viruksen kantajien limakalvoille uskotaan olevan ongelma antigeenitestauksessa. Diplomityön tavoitteena oli kehittää akuutin EBV-infektion pikadiagnostiikkaan soveltuva limakalvonäytteestä tehtävä immunometrinen antigeeniosoitustesti. Työssä kehitettiin uusia polyklonaalisia vasta-aineita sekä testattiin kaupallisia vasta-aineita. Vasta-aineiden toimintaa tutkittiin immunomäärityksissä kokonaista EBV:ta ja puhdistettuja proteiiniantigeeneja vastaan. Monoklonaalisten vasta-aineiden kehitys lopetettiin ennen varsinaista tuottoa, koska ensin kehitetyt polyklonaaliset vasta-aineet eivät tunnistaneet natiivia virusta vaan pelkästään immunisointeihin käytetyt rekombinanttiset kohdeproteiinit. Kaupallisista vasta-aineista yhdellä onnistuttiin kehittämään tiettävästi maailman ensimmäinen immunometrinen EBV-antigeeniosoitustesti, jossa saatiin tunnistus sekä natiivilla EBV:lla että puhdistetulla proteiiniantigeenilla. Testin herkkyys proteiiniantigeenilla oli hyvä (4 pM) ja puhdistetulla EBV-virusvalmisteellakin todennäköisesti riittävä (6,2×106 viruspartikkelia/ml) kliiniseen diagnostiikkaan. Testillä ei kuitenkaan saatu suppeasta mononukleoosipotilaiden nielunäyteaineistosta yhtään EBV-positiivista tulosta. Referenssiksi tilatut PCR-testit osoittivat näytteiden EBV-pitoisuuksien olevan liian alhaisia osoitettavaksi kehitetyllä EBV-antigeeniosoitustestillä. PCR-testauksessa mononukleoosipotilaiden nielunäytteistä osoitettujen alhaisten EBV-määrien perusteella spekuloitiin, että olisiko edustavin näytteenottopaikka akuutissa EBV-infektiossa sittenkin nielun sijaan nenänielu. Myös kirjallisuudesta löytyi tälle tukea. EBV-antigeeniosoitustestin osoitettiin toimivan hyvin standardinäyte-materiaalilla. Testikehitysprojektin jatkon kannalta oleellista on kuitenkin vielä selvittää laajemmalla kliinisellä näyteaineistolla, mistä EBV:n antigeeneja pitäisi osoittaa akuutissa EBV-infektiossa ja ovatko niiden pitoisuudet riittävän korkeita.

Epstein-Barr virus (EBV) is a causative agent of infectious mononucleosis (IM). Most often IM is manifested in adolescents or young adults. Symptoms in IM are like in typical pharyngitis which makes it hard to differentiate IM from pharyngitis caused by other pathogens. It is important to be able to diagnose the pathogen behind the symptoms because only pharyngitis caused by Streptococcal bacteria requires antibiotic treatment. At the moment rapid diagnostics of acute EBV infection is based on measuring heterophile antibodies arising as a result of infection. Heterophile antibodies are not the best markers for EBV infection because they do not develop in many children and even in older patients they can usually be detected only after one week of the onset of symptoms. EBV antigens would be better targets for diagnostics because they are detectable already when the symptoms appear. Lack of EBV antigen detection test might be a result from the dogma that secretion of EBV antigens in healthy people during latent infection would be a problem for the antigen detection. The objective of the master`s thesis was to develop an immunometric EBV antigen detection test suitable for the rapid diagnostics of acute EBV infection from mucosa samples. During the study new polyclonal antibodies were developed and commercial antibodies were also characterized. The antibodies were tested in immunoassays against the whole EBV and protein antigens. The development of monoclonal antibodies was stopped before the actual production because initially developed polyclonal antibodies did not recognize a native virus but only the recombinant antigens used in immunizations. Presumably a world`s first immunometric EBV antigen detection test was eventually developed with one commercial antibody. The test recognized both the native EBV and the purified protein antigen. The sensitivity with the protein antigen was high (4 pM) and with the native EBV most likely adequate (6.2×106 virus particles/ml) for clinical diagnostics. However, the test did not give any EBV positive result from throat samples of IM patients. The reference PCR test showed that the EBV concentrations were too low to be detected with the developed EBV antigen detection test. Based on the low EBV concentrations in the throat of the IM patients it was speculated that whether a nasopharynx would be a better place for sampling than a throat in acute EBV infection. This was also supported by literature. The EBV antigen detection test was shown to work well with standard antigens. However for the continuation of the test development project it is relevant to be able to examine with clinical samples where the EBV antigens should be measured during acute EBV infection and are the levels of EBV antigens even high enough to be detected with immunometric antigen detection.