The effects of mutated cationic amino acid transporter y+LAT1 at the cellular and systemic level

y+LAT1 is a transmembrane protein that, together with the 4F2hc cell surface antigen, forms a transporter for cationic amino acids in the basolateral plasma membrane of epithelial cells. It is mainly expressed in the kidney and small intestine, and to a lesser extent in other tissues, such as the placenta and immunoactive cells. Mutations in y+LAT1 lead to a defect of the y+LAT1/4F2hc transporter, which impairs intestinal absorbance and renal reabsorbance of lysine, arginine and ornithine, causing lysinuric protein intolerance (LPI), a rare, recessively inherited aminoaciduria with severe multi-organ complications. This thesis examines the consequences of the LPI-causing mutations on two levels, the transporter structure and the Finnish patients’ gene expression profiles. Using fluorescence resonance energy transfer (FRET) confocal microscopy, optimised for this work, the subunit dimerisation was discovered to be a primary phenomenon occurring regardless of mutations in y+LAT1. In flow cytometric and confocal microscopic FRET analyses, the y+LAT1 molecules exhibit a strong tendency for homodimerisation both in the presence and absence of 4F2hc, suggesting a heterotetramer for the transporter’s functional form. Gene expression analysis of the Finnish patients, clinically variable but homogenic for the LPI-causing mutation in SLC7A7, revealed 926 differentially-expressed genes and a disturbance of the amino acid homeostasis affecting several transporters. However, despite the expression changes in individual patients, no overall compensatory effect of y+LAT2, the sister y+L transporter, was detected. The functional annotations of the altered genes included biological processes such as inflammatory response, immune system processes and apoptosis, indicating a strong immunological involvement for LPI.

Kationisten aminohappojen kuljetinproteiini y+LAT1:n mutaatioiden vaikutus systeemisellä ja solutasolla y+LAT1 on solukalvoproteiini, joka yhdessä solun pinnan yleisen 4F2hc-antigeenin kanssa muodostaa epiteelisolujen basolateraalikalvolle paikantuvan kationisten aminohappojen kuljettimen. Sen pääasialliset ilmenemiskudokset ovat munuainen ja ohutsuoli, mutta se toimii pienemmässä määrin myös joissakin muissa kudoksissa, kuten istukassa ja immuuniaktiivisissa soluissa. y+LAT1:n mutaatiot aiheuttavat virheen y+LAT1/4F2hc-kuljettimeen heikentäen lysiinin, arginiinin ja ornitiinin imeytymistä ohutsuolesta verenkiertoon sekä niiden takaisinottoa alkuvirtsasta munuaisissa Tämä johtaa lysinuurisen proteiini-intoleranssiin: harvinaiseen perinnölliseen aminohappoaineenvaihduntasairauteen, johon liittyy vakavia monielinkomplikaatioita. Tämä väitöskirja tarkastelee LPI-mutaatioiden seurauksia kahdella eri tasolla: toisaalta aminohappokuljettimen rakenteen tasolla ja toisaalta suomalaisten LPI-potilaiden geeniekspressioprofiilien kautta kuljettimen toiminnan tasolla. Tässä työssä optimoitiin fluorescence resonance energy transfer (FRET) –konfokaalimikroskopiamenetelmä, jota käyttäen havaittiin kuljettimen alayksiköiden dimerisoituvan keskenään y+LAT1:n mutaatioista huolimatta. Virtaussytometriset ja FRET-konfokaalimikroskopiakokeet osoittivat y+LAT1-molekyylien pyrkivän muodostamaan homodimeerejä sekä ilman 4F2hc:ta että sen läsnä ollessa viitaten vahvasti siihen, että kuljettimen toiminnallinen kokonaisuus on heterotetrameeri. Suomalaisilla LPI-potilailla on kaikilla SLC7A7-geenissä sama LPI-mutaatio, mutta heidän kliiniset taudinkuvansa eroavat toisistaan suuresti. Potilaiden geeniekspressioanalyysi paljasti 926 ekspressioltaan muuttunutta geeniä sekä laajan, useita aminohappokuljettimia koskevan aminohappotasapainon häiriön. Yksittäisten potilaiden y+LAT2-kuljettimen ekspressiomuutoksista huolimatta tämän kuljettimen ei havaittu yleisesti kompensoivan y+LAT1:n vähentynyttä ekspressiota. Muuttuneiden geenien toiminnot liittyivät mm. tulehdusvasteeseen, immuunipuolustustoimintoihin ja apoptoosiin, mikä viittaa siihen, että LPI:llä on vahva yhteys immuunipuolustukseen.