Nucleotides as Antiviral Compounds. On the Feasibility of an Esterase-dependent Prodrug Strategy for 2-5A

Nukleotidien ja oligonukleotidien analogeilla on merkittävä rooli virusten aiheuttamien tautien hoidossa. Tämän kaltaiset yhdisteet voivat estää spesifisesti virusten proteiineja tai aktivoida luontaista immuunijärjestelmää, jossa 2-5A:ksi kutsutut lyhyet 2´,5´-sitoutuneet oligomeerit ovat keskeisiä tekijöitä. Nukleotideihin ja oligonukleotideihin pohjautuvien lääkkeiden tehokkuus riippuu pääasiassa aihiolääkestrategiasta, jolla niiden sisäänottoa soluun tehostetaan. Tavanomaisessa aihiolääkestrategiassa negatiivisesti varautuneet fosfaattiryhmät suojataan rasvaliukoisilla biohajoavilla suojaryhmillä, jotta molekyyli läpäisee solukalvon helpommin. Solun sisällä aihiolääke muuttuu aktiiviseksi lääkeaineeksi, kun suojaryhmät irtoavat solun entsyymien, kuten esteraasien vaikutuksesta. Väitöskirjassa arvioitiin esteraasin katalysoiman aihiolääkestrategian soveltuvuutta 2-5A-trimeerille syntetisoimalla kaksi erilaista 2-5A-aihiolääkekandidaattia ja tutkimalla 2-5A:n purkautumista karboksiesteraasi-entsyymin vaikutuksesta. Suojaryhmäsuunnitelma perustui esteraasilabiileihin 2,2-disubstituoituihin asyylioksipropyyliryhmiin ja asyylioksimetyyliryhmiin, joilla suojattiin trimeerien fosfaatti- ja 3´-hydroksyyliryhmät. Tulokset osoittivat, että esteraasilabiilien suojaryhmien irtoaminen 2-5A:sta hidastui merkittävästi, kun yhdisteeseen kertyi negatiivista varausta. Lisäksi suojaryhmien hajotessa muodostui elektrofiilisiä alkyloivia aineita, jotka ovat mahdollisesti toksisia. Näistä syistä johtuen kehitettiin kuusi uudenlaista 2,2,-disubstituoitua 4-asyylitio- 3-oksobutyyliryhmää fosfodiestereiden suojaamiseksi. Suojaryhmät irtoavat sekä esteraasin katalysoimana, että lämpötilan vaikutuksesta. Tämä on hyödyllinen ominaisuus silloin, kun entsyymin affiniteetti negatiivisesti varattuun substraattiin heikkenee. Suojaryhmien hydrolyyttinen ja entsymaattinen stabiilisuus on helposti säädeltävissä, jotta suojauksen purkautumisen nopeus voidaan optimoida. Vapautuneet suojaryhmät eivät ole merkittävästi alkyloivia, sillä niiden ei havaittu alkyloivan glutationia.

Analogues of nucleotides and oligonucleotides have a significant role in the antiviral therapy. These compounds may inhibit specifically viral proteins or promote the innate immune system, where short 2´,5´-linked oligomers, called 2- 5A, are the key players. The efficiency of nucleotide and oligonucleotide based drugs is largely dependent on the prodrug strategy used to enhance their cellular uptake. A common prodrug strategy includes masking of the negatively charged phosphate groups with biodegradable lipophilic protecting groups in order to facilitate permeation of the molecule through cell membrane. Inside the cell, upon unmasking by cellular enzymes, such as esterases, the prodrug is transformed into active drug. In the present thesis, the feasibility of an esterase-triggered prodrug strategy for 2-5A trimer has been evaluated by synthesizing two different 2-5A prodrug candidates and studying the release of 2-5A by carboxyesterase. The protecting group scheme was based on esterase-labile 2,2-disubstituted acyloxypropyl groups for the phosphate protection and acyloxymethyl groups for the 3´- hydroxyl protection. The results demonstrated that deprotection of 2-5A, bearing esterase-labile protecting groups, became significantly slower upon accumulation of negative charge. Additionally, decomposition of the protecting groups produced electrophilic alkylating agents, which have been associated with potential toxicity. For these reasons, six different 2,2-disubstituted 4-acylthio-3-oxobutyl groups were developed as protecting groups for phosphodiesters. These groups are cleaved by esterases, but in addition they exhibit a novel feature being removed thermally, which is an advantage when the affinity of the enzyme to a negatively charged substrate is reduced. The hydrolytic and enzymatic stability of the protecting groups is easily adjustable to optimize the deprotection rate. The released protecting groups are not markedly alkylating, since no alkylation with glutathione was observed.