Novel Cellular Luminescence Probes for Immunological and Toxicological Assessments

Escherichia coli K-12 (pEGFPluxABCDEAmp) (E. coli-lux), constitutively emitting bioluminescence (BL), was constructed and its BL emitting properties tested in different growth and killing conditions. The BL emission directly correlated with the number of viable E. coli-lux cells, and when subjected to the antimicrobial agent, the diminishment of the BL signal was linked directly to the number of killed bacterial cells. The method provided a very convenient application, especially when compared to conventional plate counting assays. This novel real-time based method was utilized in both immunological and toxicological assessments. The parameters such as the activation phase, the lytic phase and the capacity of the killing of the serum complement system were specified not only in humans but also in other species. E. coli-lux was also successfully used to study the antimicrobial activities of insect haemolymph. The mechanisms of neutrophil activity, like that of a myeloperoxidase (MPO)-H2O2-halide system, were studied using the E. coli-lux approach. The fundamental role of MPO was challenged, since during the actual killing in described circumstances in phagolysosome the MPO system was inactivated and chlorination halted. The toxicological test system, assessing indoor air total toxicity, particularly suitable for suspected mold damages, was designed based on the E. coli-lux method. Susceptibility to the vast number of various toxins, both pure chemicals and dust samples from the buildings and extracts from molds, were investigated. The E. coli-lux application was found to possess high sensitivity and specificity attributes. Alongside the analysis system, the sampling kit for indoor dust was engineered based on the swipe stick and the container. The combination of practical specimen collector and convenient analysis system provided accurate toxic data from the dust sample within hours. Neutrophils are good indicators of the pathophysiological state of the individual, and they can be utilized as a toxicological probe due to their ability to emit chemiluminescence (CL). Neutrophils can either be used as probe cells, directly exposed to the agent studied, or they can act as indicators of the whole biological system exposed to the agent. Human neutrophils were exposed to the same toxins as tested with the E. coli-lux system and measured as luminol amplified CL emission. The influence of the toxins on the individuals was investigated by exposing rats with moniliniformin, the mycotoxin commonly present in Finnish grains. The activity of the rat neutrophils was found to decrease significantly during the 28 days of exposure.

Escherichia coli K-12 transformoitiin uudella bakteerilusiferaasigeenikasetin sisältämällä pEGFPluxABCDEAmp plasmidilla. Aktiivinen bakteerilusiferaasioperoni tuottaa konstitutiivista bioluminesenssia emittoivia E. coli soluja, ilman lisättyä substraattia. Uusi konstruktio nimettiin E. coli-lux:si ja sen bioluminesenssiemissio-ominaisuuksia mitattiin erilaisissa inkubaatio-olosuhteissa. Tutkimuksissa havaittiin E. coli-lux:in tuottaman bioluminesenssin olevan suoraan verrannollinen reaktioseoksessa olevien elävien bakteerisolujen lukumäärään ja kun reaktioon lisättiin antimikrobiaalista yhdistettä, valosignaalin laskun havaittiin korreloivan kuolleiden bakteerisolujen lukumäärän kanssa. Konventionaaliseen maljalaskentamenetelmään verrattuna E. coli-lux – sovellus tarjosi erittäin käytännöllisen vaihtoehdon bakteerien elinkyvyn ja tapon mittaamiseen ja sitä hyödynnettiin tässä kirjassa esitellyissä immunologisissa ja toksikologisissa menetelmissä koetinorganismina. Synnynnäisen immuniteetin tutkimuksessa E. coli-lux konstruktiota hyödynnettiin seerumin komplementtisysteemin aktivaatioreaktioteiden kineettisten parametrien kuten aktivaatio- ja lyyttisen faasin nopeuden sekä bakteeritappokapasiteetin määrittämiseen ihmisen, kirjolohen, sian, rotan, sekä lepakon seerumeista. Komplementin komponenteille spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden sekä antiseerumeiden avulla selvitettiin tiettyjen komponenttien vaikutusta tapporeaktioon. Lisäksi E. coli-lux menetelmää käytettiin hyönteisten veren, hemolymfan, antimikrobiaalisten ominaisuuksien selvittämisessä. Polymorfonukleaaristen leukosyyttien, eli neutrofiilien aktiivisuutta, fagosytoosia ja myeloperoksidaasi (MPO) -vetyperoksidi (H2O2) -kloridi-systeemin roolia fagolysosomaalisessa mikrobitapossa tutkittiin in vivo ja in vitro olosuhteissa, käyttämällä koettimena E. coli-lux soluja. MPO-systeemin perinteinen rooli neutrofiilien pääasiallisena bakteeritappomekanismina kyseenalaistettiin, koska olosuhteissa jossa mikrobitappo tapahtuu, MPO:n klorinaatioaktiivisuus havaittiin olemattomaksi. Tulokset viittasivat H2O2:n fagolysosomaalisen konsentraation itsessään olevan riittävän suuri mikrobitappoon. E. coli-lux konstruktiota käytettiin perustana uuden, rakennuksen sisäilman kokonaistoksisuutta mittaavan menetelmän kehitykseen. Testi perustuu kohteista kerättyjen sisäpölynäytteiden analysointiin, jossa E. coli-lux altistetaan pölyistä tehdyille H2O- ja DMSO- uutoksille ja toksisuus havaitaan valoemission heikkenemisenä. Toksisuus ilmoitetaan EC50 arvoina mg pölyä/ml uutosnestettä kohden. Menetelmä pystyy tunnistamaan kosteus- ja homevaurioiden sekä muiden sisäilmaongelmia aiheuttavien myrkkylähteiden toksisuuden. Analyysimenetelmän spesifisyys ja sensitiivisyys on verrannollinen perinteisiin mammaliansoluilla tehtäviin toksisuustesteihin ja lisäksi E. coli-lux systeemi on edullisempi ja nopeampi. E. coli-lux menetelmällä löydetty toksisuus korreloi tilankäyttäjien terveyshaittojen kanssa. Analyysimenetelmän ohella on kehitetty uusi näytteenottomenetelmä, jossa huonepölyä kerätään 1 – 10 mg pyyhkäisemällä useasta eri kohdasta kuitupuikolla ja Neutrofiilit toimivat hyvänä nisäkäsyksilön patofysiologisen tilan indikaattorina ja myös niitä voidaan käyttää koetinsoluina toksikologisessa tutkimuksessa. Neutrofiilien kyky emittoida kemiluminesenssiä fagosytoosin hengitysryöpsähdyksen yhteydessä mahdollistaa solujen toiminnan havainnoinnin levynlukijalumienometrillä. Neutrofiilejä voidaan altistaa suoraan toksiineille ja Ihmisen neutrofiilejä käytettiin E. coli-lux-systeemin toksisuusmittauksissa referenssikoettimina. Neutrofiilit voivat myös toimia koko altistetun yksilön systeemin indikaattoreina ja niitä käytettiin tutkittaessa suomalaisista viljoista eristetyn mykotoksiinin, moniliformiinin, vaikutusta rottien immuunipuolustukseen 28 päivää kestäneessä subkliinisessä kokeessa. Oraaliasuspensiona annosteltu moniliformiini laski merkitsevästi rottien neutrofiilien aktiivisuutta.