Markers of Bone Turnover In Preclinical Development of Drugs for Skeletal Diseases

Skeletal tissue is constantly remodeled in a process where osteoclasts resorb old bone and osteoblasts form new bone. Balance in bone remodeling is related to age, gender and genetic factors, but also many skeletal diseases, such as osteoporosis and cancer-induced bone metastasis, cause imbalance in bone turnover and lead to decreased bone mass and increased fracture risk. Biochemical markers of bone turnover are surrogates for bone metabolism and may be used as indicators of the balance between bone resorption and formation. They are released during the remodeling process and can be conveniently and reliably measured from blood or urine by immunoassays. Most commonly used bone formation markers include N-terminal propeptides of type I collagen (PINP) and osteocalcin, whereas tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b (TRACP 5b) and C-terminal cross-linked telopeptide of type I collagen (CTX) are common resorption markers. Of these, PINP has been, until recently, the only marker not commercially available for preclinical use. To date, widespread use of bone markers is still limited due to their unclear biological significance, variability, and insufficient evidence of their prognostic value to reflect long term changes. In this study, the feasibility of bone markers as predictors of drug efficacy in preclinical osteoporosis models was elucidated. A non-radioactive PINP immunoassay for preclinical use was characterized and validated. The levels of PINP, N-terminal mid-fragment of osteocalcin, TRACP 5b and CTX were studied in preclinical osteoporosis models and the results were compared with the results obtained by traditional analysis methods such as histology, densitometry and microscopy. Changes in all bone markers at early timepoints correlated strongly with the changes observed in bone mass and bone quality parameters at the end of the study. TRACP 5b correlated strongly with the osteoclast number and CTX correlated with the osteoclast activity in both in vitro and in vivo studies. The concept “resorption index” was applied to the relation of CTX/TRACP 5b to describe the mean osteoclast activity. The index showed more substantial changes than either of the markers alone in the preclinical osteoporosis models used in this study. PINP was strongly associated with bone formation whereas osteocalcin was associated with both bone formation and resorption. These results provide novel insight into the feasibility of PINP, osteocalcin, TRACP 5b and CTX as predictors of drug efficacy in preclinical osteoporosis models. The results support clinical findings which indicate that short-term changes of these markers reflect long-term responses in bone mass and quality. Furthermore, this information may be useful when considering cost-efficient and clinically predictive drug screening and development assays for mining new drug candidates for skeletal diseases.

Luun biokemialliset merkkiaineet luustosairauksien prekliinisessä lääkekehityksessä Luun uudismuodostusta tapahtuu koko elämän ajan. Tässä prosessissa osteoklastit hajottavat vanhaa luuta ja osteoblastit muodostavat uutta luuta. Tasapainoon vaikuttaa ikä, sukupuoli ja perinnöllisyys, mutta myös monissa luustosairauksissa, kuten osteoporoosissa ja syövän luustometastaaseissa, tämä tasapaino on järkkynyt johtaen vähentyneeseen luun määrään ja lisääntyneeseen murtumaherkkyyteen. Luun biokemialliset merkkiaineet kertovat luun aineenvaihdunnasta eli hajotuksen ja muodostuksen välisestä tasapainosta. Merkkiaineita vapautuu luun uudismuodostuksessa ja niitä voidaan helposti ja luotettavasti mitata seerumista tai virtsasta immunomääritysmenetelmillä. Yleisesti käytettyjä luun muodostuksen merkkiaineita ovat tyypin I kollageenin aminoterminaalinen propeptidi (PINP) ja osteokalsiini, sekä luun hajotuksen merkkiaineita tartraatti-resistentti hapan fosfataasi alatyyppi 5b (TRACP 5b) ja tyypin I kollageenin karboksiterminaalinen telopeptidi (CTX). Näistä PINP on ainoa merkkiaine, jolle ei ole aiemmin ollut saatavilla prekliiniseen käyttöön soveltuvaa kaupallista immunomääritysmenetelmää. Tällä hetkellä biokemiallisten merkkiaineiden laajamittainen käyttö on vielä rajoittunutta, koska niihin liittyy paljon biologista ja analyyttistä variaatiota eikä niiden merkitsevyydestä ja käyttökelpoisuudesta pitkän aikavälin muutosta ennustavana tekijänä ole riittävästi näyttöä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää luuston biokemiallisten merkkiaineiden soveltuvuutta lääkemolekyylien tehokkuuden ennustajina prekliinisissä osteoporoositutkimusmalleissa. Tutkimuksessa karakterisoitiin ja validoitiin PINP:lle prekliiniseen käyttöön kehitetty immunomääritysmenetelmä. PINP:n, osteokalsiinin N-terminaalisen keskifragmentin, TRACP 5b:n ja CTX:n tasoja tutkittiin prekliinisissä osteoporoosimalleissa, ja saatuja tuloksia verrattiin perinteisillä menetelmillä kuten histologialla, tiheysmittauksilla ja mikroskopialla saatuihin tuloksiin. Kaikkien tutkittujen luuston merkkiaineiden alkuvaiheen muutosten havaittiin korreloivan kokeen lopussa nähtyihin luuston rakenteellisiin muutoksiin. TRACP 5b korreloi osteoklastien lukumäärään ja CTX osteoklastien aktiivisuuteen sekä in vitro että in vivo kokeissa. CTX/TRACP 5b suhteelle luotiin termi resorptio-indeksi, joka kuvaa osteoklastien keskimääräistä aktiivisuutta. Indeksi antoi tarkempaa tietoa kuin kumpikaan merkkiaine erikseen käytetyissä prekliinisissä osteoporoosimalleissa. PINP:n havaittiin korreloivan vahvasti luun muodostukseen, kun taas osteokalsiini kuvasi sekä luun muodostusta että hajotusta. Tämän tutkimuksen tulokset antavat uutta tietoa luun biokemiallisten merkkiaineiden soveltuvuudesta lääkemolekyylien tehokkuuden ennustajina prekliinisissä osteoporoosimalleissa. Havainnot tukevat kliinisiä tutkimuksia, joissa merkkiaineiden on havaittu korreloivan myöhemmin nähtävien luuston rakenteellisten muutosten kanssa. Tutkimuksessa saatu tieto auttaa suunniteltaessa kliinisen ennustettavuuden kannalta parempia määritysmenetelmiä, joiden avulla voidaan nopeammin ja tehokkaammin löytää uusia toimivia lääkemolekyylejä luustosairauksien hoitoon.