Síntesi de siRNAs (short interfering RNAs) modificats amb nucleobases 5-metil i 5-propinil pirimidíniques i avaluació de la seva activitat in vitro en cultius cel•lulars i de la seva estabilitat en sèrum humà. Disseny de siRNAs dirigits a la inhibició de l'expressió de mutacions de l'oncogen K-ras.

Projecte de recerca elaborat a partir d’una estada a la Stanford University, EEUU, entre 2007 i 2009. El present projecte es basa 1) en la síntesi de cadenes d'ARN dirigides a la inhibició de l'expressió gènica per un mecanisme d'ARN d'interferència (siRNAs o short interefering RNAs) i 2) en l'avaluació de l'activitat in vitro d'aquests oligonucleòtids en cultius cel•lulars. Concretament, la meva recerca ha estat enfocada principalment a l'estudi de cadenes de siRNA modificades amb nucleobases 5-metil i 5-propinil pirimidíniques. Es tractava d'avaluar l'efecte que exerceixen els factors estèrics en el major groove (solc major) dels siRNAs sobre la seva activitat biològica. En aquest sentit, he dut aterme síntesi de fosforamidits de nucleòsis pirimidínics modificats a la posició C-5 de la nucleobase. A continuació he incorporat aquestes unitats nucleosídiques en cadenes d'ARN emprant un sintetitzador d’ADN/ARN i he estudiat l'estabilitat dels corresponents dúplexs d'ARN mitjançant experiments de desnaturalització tèrmica. Finalment he dut a terme experiments d'inhibició de l'expressió gènica en cèl.lules HeLa per tal d'avaluar l'activitat biològia d'aquests siRNAs modificats. Els resultats d'aquests estudis han posat de manifest que la presència de grups voluminosos com el propinil a l'extrem 5' del dúplex de siRNA (definit per la cadena guia o antisense) influeix de forma molt negativa en la seva activitat biològica. En canvi, grups menys voluminosos com el metil hi influeixen positivament, de manera que algunes de les cadenes sintetitzades han resultat ser més actives que els corresponents siRNAs naturals (wild type siRNAs). A més, aquest tipus de modificació contribueix positivament en l'estabilitat de cadenes de siRNA en sèrum humà. Aquest treball ha estat publicat (Terrazas, M.; Kool, E.T. "Major Groove Modifications Improve siRNA Stability and Biological Activity" Nucleic Acids Res. 2009, in press).

Report for the scientific sojourn at the Stanford University, USA, from 2007 to 2009. The present project focuses 1) on the synthesis of oligoribonucleotides aimed at the inhibition of gene expression by an RNA interference mechanism (siRNAs or short interefering RNAs) and 2) on the evaluation of their in vitro activity in cell cultures. In particular, my research focused on the study of chemically modified siRNAs containing 5-mehyl and 5-propynyl pyrimidine nucleobases. The goal of this study was to explore the effects of these RNA major groove modifications on RNAi activity. In this context, I have been working on the synthesis of C-5 modified pyrimidine nucleoside phosphoramidites. Then, I have incorporated these units into oligoribonucleotide strands by using a DNA/RNA synthesizer and evaluated the thermal stability of the corresponding duplexes through thermal denaturation studies. Finally, I have carried out RNA interference studies on HeLa cells to evaluate the bilogical activity of the modified siRNAs. These studies have shown that, at the 5’ half of the siRNA duplex (as defined by the antisense strand), the bulky 5-propynyl modification is detrimental to RNA interference activity. However, the smaller methyl group was found to have positive effects on gene suppression activity of the siRNAs; some of the 5-methyl modified siRNAs had biological activity higher than natural ones. Moreover, this modification contributed positively to stability of siRNAs in human serum. This work has been published (Terrazas, M.; Kool, E.T. "Major Groove Modifications Improve siRNA Stability and Biological Activity" Nucleic Acids Res. 2009, in press).