Determinació de la regió del genoma o gens implicats en la síntesi del polièster extracel•lular present en la variant llisa de Mycobacterium vaccae mitjançant transformació

Estudi realitzat a partir d’una estada a la Universidad de Zaragoza, Espanya, entre novembre del 2007 i abril del 2008. Mycobacterium vaccae és un micobacteri ambiental de creixement ràpid molt estudiat pel seu interès com a possible ús immunoterapéutic en el tractament de la tuberculosis i altres malalties. M.vaccae a l’igual que altres micobacteris presenta dues morfologies colonials: llisa i rugosa. M.vaccae ATCC15483T té originàriament una morfologia llisa. Quant aquest es cultiva en medi sòlid a 30ºC apareixen espontàniament variants rugoses estables que no reverteixen a llises. El motiu pel qual aquest procés té lloc no es coneix, encara que s’ha descrit en Mycobacterium smegmatis i en Mycobacterium avium que els lípids de la paret cel•lular es troben involucrats en aquest canvi de morfologia colonial. L’anàlisi dels contingut en lípids i glicolípids de la paret cel•lular de les dos variants morfològiques de M.vaccae, ens ha indicat que les soques llises presenten un compost extracel•lular que no es troba en les rugoses i que mitjançant l’anàlisi estructural d’aquest compost ha sigut identificat com un polièster extracel•lular de cadena llarga. El present estudi s’ha centrat en determinar els gens implicats en la síntesis d’aquest compost. Per a realitzar aquest anàlisi genètic s’ha construit una llibreria de mutants per transposició de la soca llisa de M. vaccae mitjançant un plàsmid ts/sac i un transposó. S’han obtingut colònies de morfologia rugosa on el plàsmid s’ha insertat en la zona del genoma que codifica per aquest compost extracel•lular. Aquests nous mutants s’han analitzat mitjançant tècniques moleculars (PCR, Southern y seqüenciació). A mès, s’ha construit una llibreria genòmica amb DNA de la soca llisa en plàsmids replicatius de micobacteris derivats de pAL5000 i s’ha transformat la soca rugosa seleccionant per a un fenotip llis estudiant els gens que complementen.

Report for the scientific sojourn at the the Universidad de Zaragoza, Spain, from november 2007 to april 2008. Mycobacterium vaccae is fast growing environmental mycobacteria that has been throughly studied for its possible immunotherapeutic use as adjunctive to the current chemotherapy in tuberculosis and others diseases. M. vaccae displays smooth and rough colony morphologies. M. vaccae 15483 ATTCT displays originally smooth morphology but it spontaneously appears a rough phenotype when it’s cultivated in solid media at 30ºC. It is unknown the reason why this process occurs, although in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium avium have been recently described that the cell wall lipids are involved in the colonial morphology changes. The analysis to the composition of the cell wall in both M. vaccae colonial morphologies has showed that the smooth morphotype presents an extracellular material that has never previously been described and it has been identified as a long-chain saturated polyester. Interestingly this compound is not produced by the rough morphotype. After these studies we aimed to determine the genes involved in its synthesis. To carry out this genetic analysis we constructed a library of mutants from the smooth M. vaccae by transposition, using a ts-sacB vector and a transposon. Using these mutants we obtained rough colony variants in which the transposon was inserted in the genome zone that codify for the extracellular compound. These news mutants were analyzed using molecular tools (PCR, Southern and sequencing). In addition, we constructed a genomic library with the smooth M. vaccae DNA in replicative mycobacterial plasmids and we transformed the rough M. vaccae with this genomic library.