Role of sirtuin 3 on mitochondrial dynamics in Huntington's disease striatal cells

Dissertação de mestrado em Genética Molecular

Altered mitochondrial dynamics has been implicated in the pathogenesis of several neurodegenerative disorders, including Huntington’s disease (HD). Sirtuins, NAD+-dependent lysine deacetylases, have emerged as important cellular targets that can interfere with mitochondrial biogenesis, fission/fusion, motility and mitophagy. Among them, sirtuin 3 (SIRT3) is particularly relevant, being the main deacetylase located in mitochondria. Here we evaluated the influence of SIRT3 on mitochondrial dynamics using striatal cells derived from HD knock-in mice (STHdhQ111/Q111) versus wild-type cells (STHdhQ7/Q7). Increased mitochondrial fragmentation was observed in untransfected HD cells. Indeed, STHdhQ111/Q111 cells exhibited an overall decrease in the levels of mitochondrial fusion proteins (Mfn2, OPA1) and an increase in fission-related Fis1. Drp1 (also involved in mitochondrial fission) was preferentially accumulated in the mitochondrial fraction of HD cells. Increased LC3-II/I ratio, which evaluates autophagosome formation, was observed in STHdhQ111/Q111 cells. Moreover, the autophagy adaptor p62 was found to be decreased in mutant cells. Parkin and PINK1, two markers of mitophagy, were also assessed. Untransfected HD cells exhibited lower levels of both proteins. No significant changes were detected in phosphorylated Parkin (required for its enzymatic activation and mitochondrial translocation). These data suggest that PINK1/Parkin-dependent mitophagy is impaired in HD striatal cells. Overexpression (OE) of SIRT3 reduced the unbalance between fission/fusion by decreasing the protein levels of Fis1 in STHdhQ7/Q7 and STHdhQ111/Q111 cells, and Drp1 accumulation in mitochondria in STHdhQ111/Q111 cells. Concordantly, an increased number of mutant cells presenting tubular mitochondria was observed after SIRT3OE. An additional significant increase in LC3-II/I ratio was observed in STHdhQ111/Q111-SIRT3 cells, indicative of macroautophagy activation. Data suggest that enhanced SIRT3 levels restore mitochondrial morphology in mutant cells by reducing mitochondrial fission, with additional activation of macroautophagy.1

Alterações na dinâmica mitocondrial têm sido relacionadas com diversas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Huntington (DH). As sirtuínas são deacetilases de lisinas dependentes de NAD+ que demonstraram ter um papel importante no re-estabelecimento do equilíbrio entre biogénese e fissão/fusão mitocondrial, e mitofagia. De todas, a sirtuína 3 (SIRT3) destaca-se por ser a deacetilase predominantemente localizada na mitocôndria com maior número de alvos proteícos. Neste trabalho avaliou-se o efeito da SIRT3 na dinâmica mitocondrial recorrendo ao uso de células estriatais derivadas de murganhos knock-in para a DH (STHdhQ111/Q111) versus células ‘wild-type’ (STHdhQ7/Q7). As células mutantes não transfetadas apresentaram um aumento da fragmentação mitocondrial. De facto, as células STHdhQ111/Q111 apresentaram um decréscimo dos níveis proteícos de Mfn2 e OPA1, duas proteínas envolvidas na fusão mitocondrial, e um aumento de Fis1, uma proteína relacionada com a fissão mitocondrial. Verificou-se ainda uma acumulação preferencial da Drp1 (também envolvida na fissão mitocondrial) na fração mitocondrial das células STHdhQ111/Q111. Embora se tenha observado um aumento do rácio LC3-II/I (que avalia a formação de autofagossomas) nas células STHdhQ111/Q111, os níveis do adaptador autofágico p62 encontraram-se diminuídos. Células mutantes não transfetadas apresentaram ainda uma redução dos níveis de Parkina e PINK1, dois marcadores do processo mitofágico. Contudo, não se observaram diferenças significativas nos níveis da forma fosforilada da Parkina (indicador da sua ativação enzimática e translocação para a mitocôndria). Estas evidências sugerem alterações deste processo mitofágico nas células mutantes. A sobre-expressão de SIRT3 reduziu o desequilíbrio entre fissão/fusão ao diminuir os níveis de Fis1 nas células STHdhQ7/Q7 e STHdhQ111/Q111, e a acumulação da Drp1 na mitocôndria nas células STHdhQ111/Q111. Consequentemente, observou-se um aumentou do número de células mutantes com mitocôndrias tubulares. Verificou-se ainda um aumento significativo do rácio LC3-II/I nas células STHdhQ111/Q111- -SIRT3, indicativo de uma ativação da macroautofagia. Em conclusão, o aumento dos níveis de SIRT3 permite restaurar a morfologia mitochondrial em células mutantes ao reduzir a fissão mitocondrial, conduzindo ainda à ativação da macroautofagia.

Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - Project reference: EXPL/BIM-MEC/2220/2013;

This work was funded by FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE;

Fundação Luso-Americana para o Desenvolvimento (FLAD);

Gabinete de Apoio à Investigação, funded by FMUC and Santander Totta Bank;

Center for Neuroscience and Cell Biology (CNC) is supported by projects PEst-C/SAU/LA0001/2013-2014 and UID/NEU/04539/2013.