Microfluidic based on aqueous two-phase system for plasmidic DNA purification

Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (área de especialização em Biotecnologia)

Through the last four decades, plasmids played a crucial role in the development of biotechnology. They are the workhorse of contemporary molecular biology being used for DNA manipulation, transfer, and gene expression in a variety of microorganisms and animal cells. As the next generation of biotechnology products (gene-based medicines and DNA vaccines) makes their way into clinical trials aspiring the pharmaceutical marketplace, the demand for high yield production and purification methods of pDNA, particularly supercoiled (sc) pDNA, has vastly increased. The approaches currently employed for pDNA purification are time consuming, laborintensive and expensive. Additionally, these are hampered by their low binding capacity. Aqueous two-phase system (ATPS) – a liquid-liquid extraction method that involves the transfer of solute between incompatible aqueous solutions – are an appealing alternative method for sc pDNA purification that reduces the number of unit operations of the expensive purification process flow presently employed, thus reducing its overall cost. Nevertheless, pDNA single-stage batch extractions in some cases does not meet sufficient purity requirements considering the product final application; and multi-stage extractions demands an increase in unit operations, time consumption, sample amount and handling, and a reduction on the amount of pDNA recovered. In this context, microfluidics-based platforms are an attractive alternative to standard batch processes currently used at the bench scale. These platforms demand smaller sample volumes, reduced reagent consumption, reduced production of potentially harmful byproducts, decreased analysis time, higher levels of throughput, automation and precise control, and have the potential of being low cost, disposable and portable. Hence, the present work aimed to perform the proof-of-concept concerning the purification of pDNA from E. coli lysates using a microfluidic based on PEG600– Ammonium Sulfate ATPS. The obtained results proved that pDNA purification using a microfluidic device was successfully achieved without evidence of RNA contamination. Also, the dimensional analysis of the relationships behind the physical phenomena explored in this study may be used to build a mathematical model and minimize the number of experiments for the microfluidic design parameters; ultimately leading to the optimization of pDNA microfluidic purification.

Ao longo das últimas quatro décadas, os plasmídeos desempenharam um papel crucial no desenvolvimento da biotecnologia. Atualmente eles são a força motriz da biologia molecular contemporânea sendo utilizados para manipulação genética, transferência e expressão de genes numa variedade de microorganismos e células animais. À medida que a próxima geração de produtos biotecnológicos (medicamentos à base de genes e vacinas de DNA) avança para ensaios clínicos, aspirando a entrada no mercado farmacêutico; a demanda por métodos de produção e purificação de alto rendimento de DNA plasmídico (pDNA) – especialmente na sua forma superenrolada (sc) – aumentou rapidamente. As abordagens atualmente empregues para a purificação de pDNA são demoradas e caras. Além disso, a maior parte das técnicas utilizadas apresentam sua baixa capacidade de ligação ao pDNA. Os sistemas de duas fases aquosas (SDFA) – um método de extracção líquido-líquido que envolve a transferência de soluto entre soluções aquosas imiscíveis – são um método apelativo e alternativo para a purificação de sc pDNA que reduz o número de operações unitárias, caraterísticas dos dispendiosos processos de purificação atualmente utilizados reduzindo assim o seu custo global. Contudo, quer a extração de pDNA num único estágio quer em multi-estágios, em alguns casos não atende os requisitos de pureza mínimos de acordo com a aplicação final do produto; mais ainda, as extrações em multi-estágios implicam um aumento do número de operações unitárias, do consumo de tempo, da quantidade de amostra e sua manipulação, e uma diminuição do rendimento. Neste contexto, as plataformas microfluidicas são uma atraente alternativa aos processos descontínuos convencionais presentemente utilizados à escala laboratorial. Estas plataformas envolvem menores volumes de amostra, reduzido consumo de reagentes, diminuição da produção de subprodutos potencialmente nocivos, diminuição do tempo de análise, rendimentos mais elevados, controlo preciso e automação; e sendo tendencialmente de baixo custo, portáteis e descartáveis. Assim, o presente trabalho teve como objetivo realizar a prova-de-conceito da purificação de pDNA a partir de lisados de E. coli utilizando um sistema microfluídico baseado num SDFA PEG600–Sulfato de Amónio. Os resultados obtidos provaram que a purificação pDNA através de um dispositivo microfluídico foi atingida com sucesso, sem evidência de contaminação com RNA. Além disso, a análise dimensional das relações inerentes aos fenómenos físicos explorados neste estudo poderá ser usada para construir um modelo matemático que permita minimizar o número de experiências necessárias para o determinar os parâmetros microfluídicos; o que, em última análise, permitirá otimização da purificação do pDNA à escala microfluídica.