Understanding adaptation to pH in an industrially relevant glycoside hydrolase family 8 xylanase

Dissertação de mestrado em Genética Molecular

Endo-1,4-β-xylanases are glycoside hydrolases that randomly cleave the backbone β-1,4- glycosidic bonds of the complex heteropolysaccharide xylan. pXyl from the Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a is a cold-adapted xylanase which is currently being commercialised for baking applications. This enzyme has been the subject of a number of studies yet the pH dependence of its activity and stability is still poorly understood. Such an understanding is particularly important for this enzyme as it has many potential applications which require stability and/or activity at the extremes of pH. This study aimed at overcoming the lack of knowledge regarding the pH adaptation of this enzyme and in understanding the molecular determinants of adaptation to pH. We focused on activity and on the active site and on improving activity at low pHs by decreasing the pKa and thereby delaying protonation of the proton acceptor (D281). Careful in silico analysis and rational design was used in an attempt to design suitable active site mutations which would decrease the pKa of D281 but have minimal effects on the specific activity, substrate binding and stability. Three approaches were used: substitution of negative charges near D281 (E279Q, E279R, E279K, E279S), strengthening of an H-bond to D281 (D200E) and using cysteine sulfinic acid as the proton acceptor in place of aspartic acid (D281C). All mutants and wild type were successfully produced, purified and characterised but, unfortunately, all mutants were found to display accentuated decreases in specific activity. Furthermore, the charge shift mutations (E279R, E279K) led to instability. Interestingly, E279Q and E279S showed slight increases in relative activities at pHs 4.4 and 4.7 as compared to wildtype enzyme. Furthermore, analysis of wild type protein indicated that at these and lower pHs protein precipitation and instability became predominant. Therefore, our results indicate that a shift in pKa was possibly achieved here but that it is masked by structural instability at these pHs and also, importantly, that these mutations perturb the delicate balance of interactions at the active site and lead to the observed loss of activity. This displays the complexity of the active site and of the difficulties in engineering it, as well as of the importance of engineering both protein stability and activity so as to achieve low pH activity.

Endo-1,4-β-xilanases são glicosil hidrolases que clivam de forma aleatória as ligações glicosídicas β-1,4 da cadeia principal do xilano, um heteropolissacarídeo complexo. A proteína pXyl oriunda da bactéria Antárctica Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a é uma xilanase adaptada a baixas temperaturas que está a ser comercializada para a industria da panificação. Esta enzima foi alvo de vários estudos, no entanto, a dependência da actividade e estabilidade desta enzima em relação ao pH ainda não é bem compreendida. É importante estudar e entender a dependência desta enzima em relação ao pH, uma vez que existem potênciais aplicações que requerem a estabilidade e/ou actividade da enzima em pHs extremos. Este estudo teve como objectivo superar a falta de conhecimento sobre a adaptação desta enzima ao pH e na compreensão dos determinantes moleculares de adaptação ao pH. Este estudo focou-se na actividade, no sítio activo e no aumento da actividade a pHs baixos, através da diminuição do pKa da base catalítica (D281) e consequente atraso da sua protonação a pHs baixos. Foi feita uma cuidadosa análise in silico e de desenho racional numa tentativa de conceber mutações no sítio activo que poderiam diminuir o pKa de D281, mas com efeitos mínimos sobre a actividade específica, a ligação do substrato e estabilidade da enzima. Foram utilizadas três abordagens: a substituição de cargas negativas próximos do resíduo D281 (E279Q, E279R, E279K, E279S); o reforço de uma ponte de hidrogénio existente entre D281 e residuos vizinhos (D200E) e a utilização de uma versão oxidada da cisteína como a base catalítica, no lugar do ácido aspártico (D281C). Todos os mutantes e a pXyl foram produzidos com êxito, purificados e caracterizados mas, infelizmente, todos os mutantes exibiram diminuições acentuadas na actividade específica. Além disso, as mutações de troca de carga (E279R, E279K) levaram a instabilidade da proteína. Curiosamente, os mutantes E279Q e E279S mostraram ligeiros aumentos da actividade relativas a valores de pH 4,4 e 4,7, em comparação com a pXyl. Adicionalmente, a análise da pXyl indicou que a estes pHs, a precipitação e a instabilidade da proteína tornam-se predominantes. Por conseguinte, os nossos resultados indicam para a possibilidade de uma mudança no pKa ter sido alcançada nos mutantes desenhados, mas que esta mudança é mascarada pela instabilidade estrutural característica destes valores de pH e pelas perturbações causadas no delicado equilíbrio de interacções no local activo que levou à observada perda de actividade. Estes resultados mostram a complexidade do sítio activo e as dificuldades de redesenha-lo, assim como a importância da engenharia de proteínas. tanto para estabilidade como para a actividade da proteína.