Topography of aligned PNIPAm nanogels determines cell motility and cytoskeleton architecture

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)

Tissue engineering has become a very important and rapidly changing field of biomedical research and it has important implications for medical practice. The effects of structured surfaces, such as grooves, on different cell types have been extensively investigated. When in contact with such substrates, cells become elongated, align with the grooves, and then migrate along grooves direction. This phenomenon is known as contact guidance. The ability of cells to adhere and move on specific substrates is important in the field of tissue engineering and biomaterials as it offers the possibility to modulate cell function. The present study aimed to understand the influence of aligned PNIPAm nanogels topography on the adhesion, alignment and migration of cultured cells. Different cell types were seeded on structured nanogels to evaluate their movement and alignment, and some parameters of B16F1 cell’s motility, like speed and movement directionality, were analyzed. B16F1 cells were also used to evaluate the nanogel-cell interaction, using the fluorescent staining of different cell cytoskeleton structures such as vinculin, a protein present in focal adhesions. Moreover, protein-coated and uncoated nanogels were analyzed by atomic force microscopy to evaluate whether or not this coating would affect surface topography. It was found that cells aligned and elongated in the direction of the nanogels. In addition, all analyzed cytoskeleton structures responded to the aligned nanogels. In the case of structured nanogels, focal adhesions were fewer, smaller and aligned along nanogel lines. Immunofluorescence experiments did not show big differences between cells seeded on glass coverslips and flat nanogels, suggesting that nanogel chemical composition did not affect cell cytoskeleton. Quantitative analysis of cell motility demonstrated that cell speed was lower in the presence of flat nanogels, compared to cells plated on glass coverslips. Furthermore, cells moved slower when they were along nanogel lines, maintaining a strictly defined directional movement. Taken together, this project demonstrates that aligned PNIPAm nanogels could be used to influence cell’s cytoskeleton architecture and, therefore, cell behaviour, including adhesion and migration.

A engenharia de tecidos tem-se tornado numa área da investigação biomédica muito importante e de rápida evolução, tendo importantes implicações para a prática médica. Os efeitos de superfícies estruturadas em diferentes tipos de células têm sido extensivamente estudados. Quando em contacto com substratos ranhurados, as células tornam-se alongadas, alinhadas com as ranhuras, e migram na direção das ranhuras. O estudo desta influência de diferentes substratos no comportamento celular é importante na engenharia de tecidos e biomateriais, uma vez que oferece a possibilidade de modular a função das células. O presente estudo tinha como objetivo compreender a influência da topografia de nanogeis alinhados de PNIPAm na adesão, alinhamento e migração de células em cultura. Para tal, foram cultivados diferentes tipos de células em nanogeis estruturados para avaliar o seu movimento e alinhamento, e foram também analisados alguns parâmetros da motilidade das células B16F1. As células B16F1 foram igualmente utilizadas para avaliar a interação célulananogel, utilizando a microscopia de fluorescência para visualizar diferentes estruturas do citoesqueleto celular, tais como a vinculina, uma proteína presente nas adesões focais. Além disso, os nanogeis revestidos e não revestidos com proteína foram analisados por microscopia de força atómica para avaliar se este revestimento iria ou não afetar a topografia da superfície. Verificou-se que as células alinharam e alongaram-se na direção das linhas de nanogéis. Para além disso, todas as estruturas do citoesqueleto analisadas foram influenciadas por esta estrutura de nanogéis. No caso dos nanogéis alinhados, as adesões focais eram menores, estavam em menor número e alinhadas com as linhas de nanogéis. Os ensaios de imunofluorescência não mostraram grandes diferenças entre células cultivadas em lamelas de vidro e numa monocamada de nanogels, sugerindo que a composição química destes nanogéis não afeta o citoesqueleto celular. A análise quantitativa da motilidade das células demonstrou que a velocidade das mesmas foi inferior quando estas foram cultivadas na monocamada de nanogéis, em comparação com as células cultivadas em lamelas de vidro. Além disso, as células moveram-se com uma velocidade menor quando foram cultivadas nas linhas de nanogéis, mantendo um movimento direcional estritamente definido. Em conclusão, este estudo demonstrou que os nanogéis PNIPAm alinhados poderiam ser utlizados para influenciar a estrutura do citoesqueleto celular e, por conseguinte, o comportamento das células, incluindo a adesão e migração.