Exploring the role of O-Mannosylation in the modulation of E-Cadherin function in Gastric Cancer cell line models

Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada – Biomedicina

The establishment of stable adherens junctions by the action of the E-Cadherin (E-Cad)-catenins complex is essential for epithelial tissue architecture and mechanical integrity, contributing effectively for tumor suppression. Therefore, E-Cad impairment is often associated with loss of adhesive properties of epithelial cells, invasiveness and metastasis. As E-Cad is a glycoprotein, it can be modified by N- and O-glycans, specifically O-mannose (O-Man) glycans. N-glycosylation and O-mannosylation initiate at the endoplasmic reticulum (ER), carry on in the Golgi compartment, and terminate when the glycoprotein is released to the cytoplasm or liberated in vesicles for the cellular membrane. The initial monosaccharide residues can be further extended in the several compartments of the Golgi apparatus by the action of several glycosyltransferases: in the case of N-glycosylation, N-acetylglucosamyniltransferases (GnTs) III and V (GnT-III and GnT-V) are often involved in the modification of the glycan structure by the addition of a bisecting N-acetylglucosamine (GlcNAc) or β-1,6 GlcNAc branching residue, respectively. While the formation of bisecting GlcNAc N-glycans by GnT-III has been proven to be tumor suppressor, high levels of β-1,6 GlcNAc branching N-glycans formed by the action of GnT-V are usually associated with highly metastatic tumors. Work by our group allowed us to describe the impact of the activity of these two enzymes in E-Cad expression and regulation, specifically in a gastric cancer (GC) context that cannot be explained solely by genetic or epigenetic alterations. Recently, O-mannosylation gained interest relating to E-Cad, as it was described that E-Cad presents several available O-mannosylation sites, and that the O-Man glycans present on E-Cad contribute to its biological functions, namely cell-cell adhesion. This work aims to understand how O-mannosylation modulates E-Cad functions in tumor development and progression, and to figure out the interplay between O-mannosylation and N-glycosylation in this context. Our results clearly indicate that the gaining of differentiation status of a cell line is accompanied by an increase in the cellular overall O-mannosylation profile, and that E-Cad presents higher levels of O-Man glycans attached to it in that case. On the other hand, we observed that the increase in O-Man glycans and the decrease of branched GlcNAc N-glycans attached to E-Cad is related to a more stable phenotype. These results support the idea that O-mannosylation of E-Cad is essential for its biological functions, and that the absence of this post-translational modification (PTM) may be one of the key elements for the impairment of this glycoprotein, which leads to tumor development and progression. Globally, the main goal of this project is to further clarify the molecular mechanisms behind E-Cad dysfunction in GC that are important in the setting up of human adenocarcinomas, having in mind potential new applications in the clinic. The work that is present here was developed as part of a comprehensive project that aims to explore the O-mannosylation profile of E-Cadherin in Gastric Cancer, carried out by me and Sandra Carvalho (PhD Student that co-supervised this work), which will culminate in the preparation of a manuscript to be submitted for publication.

A acção do complexo E-Caderina (E-Cad)-cateninas para a formação de junções aderentes estáveis é essencial para a arquitectura de tecidos epiteliais e para a sua integridade mecânica, contribuindo de forma preponderante para a supressão tumoral. Assim, a disfunção da E-Cad está geralmente associada com a perda das propriedades de adesão das células epiteliais, com a capacidade de invasão, e com metastização. Como a E-Cad é uma glicoproteína, ela pode ser modificada por N- ou por O-glicanos, especificamente por glicanos O-manose (O-Man). A N-glicosilação e a O-manosilação iniciam-se no retículo endoplasmático (ER), seguindo para o complexo de Golgi, e terminando quando a glicoproteína é libertada no citoplasma ou em vesículas para ser transportada para a membrana celular. Os monossacáridos iniciais podem ser estendidos em diversos compartimentos do complexo de Golgi por acção de diversas glicosiltransferases: no caso da N-glicosilação, as N-acetilglucosaminiltransferases (GnTs) III e V (GnT-III e GnT-V) estão regularmente envolvidas na modificação da estrutura do glicano pela adição de um resíduo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisecting ou β-1,6 GlcNAc branching, respectivamente. Enquanto a formação de N-glicanos com bisecting GlcNAc por acção da GnT-III leva à supressão tumoral, elevados níveis de N-glicanos β-1,6 GlcNAc branching formados por acção da GnT-V são geralmente associados a tumores altamente metastáticos. Trabalhos prévios do nosso grupo permitiram descrever o impacto da actividade destas duas enzimas na expressão e regulação da E-Cad, especificamente num contexto de cancro gástrico (GC) que não pode ser explicado apenas devido a alterações genéticas e epigenéticas. Recentemente, a O-manosilação ganhou um novo interesse quando relacionada com a E-Cad, uma vez que foram descritos diversos locais de O-manosilação disponíveis na E-Cad, e que os glicanos O-Man presentes na E-Cad contribuem para as suas funções biológicas, nomeadamente para a adesão célula-célula. Este trabalho pretende compreender o papel da O-manosilação na modulação das funções da E-Cad num contexto de desenvolvimento e progressão tumoral, bem como perceber qual a relação, neste contexto, entre a O-manosilação e a N-glicosilação. Os resultados obtidos indicam claramente que o aumento de diferenciação de uma linha celular é acompanhado por um aumento no perfil geral de O-manosilação na célula, e que a E-Cad apresenta níveis mais elevados de glicanos O-Man ligados nesse caso. Por outro lado, observamos que o aumento de glicanos O-Man e a diminuição de glicanos GlcNAc branched ligados à E-Cad está relacionado com um fenótipo mais estável. Estes resultados apoiam o conceito de que a O-manosilação da E-Cad é essencial para as suas funções biológicas, e que a ausência desta modificação pós-traducional (PTM) pode ser um dos factores chave para a perda de função desta glicoproteína, o que leva ao desenvolvimento e progressão tumoral. De modo global, o objectivo principal deste projecto é clarificar ainda mais os mecanismos moleculares que conduzem à disfunção da E-Cad no GC e que são fundamentais para o estabelecimento de adenocarcinomas humanos, tendo em vista potenciais novas aplicações na cliníca. O trabalho aqui apresentado foi desenvolvido como parte integrante de um projecto que visa explorar o perfil de O-manosilação da E-Caderina no cancro gástrico, tendo sido desenvolvido por mim e pela Sandra Carvalho (Estudante de Doutoramento que co-orientou este trabalho), culminando com a preparação de um artigo para ser submetido para publicação.